第六章 分析方法及评价

 

教学重点与难点:微量物证与毒物毒品分析中常用的定性与定量方法、特点与应用;分析方法的认证体系与评价指标。

微量物证与毒物毒品分析是以分析化学基础理论为依据,以与违法犯罪有关的微量物证和毒物毒品为研究对象进行定性定量分析,从而服务于国家法制建设的一门应用性学科。分析的结果可以为违法犯罪行为提供科学的证据;可以提供侦查线索、缩小侦查范围;可以提供物证中有价值的情报和信息。而获得准确分析结果的基础是建立可靠的分析方法。

第一节分析方法概述

根据分析方法所依据的原理,可将分析方法分为物理方法、化学方法、生化方法和仪器分析方法。

一、物理方法

物理方法是利用人的感官或借助简单的工具对微量物证及毒物毒品物证的颜色、气味、物理状态及外观等外在特性进行观察、比较,并对其物理性能如溶解度、熔点、沸点、密度、比重、荧光、折光性、旋光性等进行测试,一般不需要对检材进行处理或只需要简单的清洁处理,不损坏检材。能够提供检材的某些物理信息,属于定性分析方法,但专属性差。

二、化学方法

化学方法是利用化学反应原理,通过化学反应过程中产生的特殊现象(如颜色、气味、沉淀、结晶等)快速判断检材中物质的属性和特点。化学方法可提供检材中是否存在某种成分的信息,但专属性差、灵敏度不高,可能存在假阳性和假阴性现象。化学方法破坏检材,但一般不需要对检材进行处理,检测速度快,现象特征,常作为现场快速检测方法和仪器分析前筛选方法。

三、生化方法

生化方法主要是利用免疫方法(Immunoassay IA),即利用竞争结合的原理进行检测的方法。该方法是将药物或毒物作为半抗原,与载体蛋白(如牛血清蛋白)结合成完全抗原,然后将这种抗原注射到动物体内产生免疫反应,生成对该药物或毒物具有特异性的抗体(Ab),用该抗体与标记的药物或毒物(标记抗原Ag*,已知的待测物)及未标记药物或毒物(未标记抗原Ag,即待测物)反应,形成抗原抗体结合物(Ag-Ab,Ag*-Ab)。

抗体Ab与Ag和Ag*的结合反应没有选择性,具有相同的亲和力,结合机会均等。因此当待测物存在或浓度(Ag)增加时,会导致标记的Ag*信号降低,据此可对待测物进行定性和定量测试。免疫分析按标记物不同可分为以放射性元素作为标记物的放射免疫分析(Radio immunoassay, RIA)、以酶作为标记物的酶免疫分析(Enzyme immunoassay,EIA)、以荧光物质作为标记物的荧光免疫分析(Fluro immunoassay,FIA)和以游离基作为标记物的电子自旋共振免疫分析(Electro spin immunoassay,SIA)等。

免疫分析方法灵敏度高、选择性强、操作简单、检材用量少,阴性结果可排除某些药、毒物的存在,阳性结果需要进一步做实验室验证试验。目前常作为现场中毒或吸毒的快速检验方法。对于液体生物检材,如尿液和唾液,可直接进行检测,血液检材需要沉淀蛋白后对澄清液进行检测。

四、薄层色谱法

薄层色谱是色谱法中的一种,是对混合物中的待测物进行分离分析的方法,分离原理与第五章现代仪器分析中的色谱法一致,只是固定相涂铺在玻璃、金属或塑料薄板的光洁表面上,操作过程为手工操作。分析时,将待测混合物用毛细管点在薄层板的一端,将薄层板(点样端朝下)置于装有一定量展开剂的密闭展开槽中,展开剂(即流动相)通过毛细作用向上运动,携带样品通过固定相,待测物依据在两相间的分配系数不同实现分离,形成不同展开距离的待测物斑点。如果待测物具有颜色,可直观地观察到分离后的斑点,如果没有颜色可通过显色剂显出斑点,或通过薄层扫描仪进行检测。待测物的展开距离与展开剂前沿距离的比值,称作比移植(Rf),同色谱法保留值相同,是定性的参数。斑点浓度的大小可作为定量的参数。固定相的种类主要为吸附剂,如硅胶、氧化铝和聚酰胺等,一般为多孔性微粒,具有较大的表面积,在其表面有许多吸附中心。这些中心的多少及其吸附能力直接影响吸附剂的性能,如常用吸附剂硅胶表面的硅醇基(—SiOH)为吸附中心,对不同极性的物质具有不同的吸附能力。展开剂多为多元混合有机溶剂,改变展开剂的极性可改变待测物在两相间的分配系数,进而改变分离效果。

薄层色谱法不需要昂贵的设备,操作简单,不存在体系污染,是早期微量物证和毒物毒品分析常用的分析方法,在不具备色谱分析仪器的实验室,依然可作为一种有效的分析方法。

五、仪器分析方法

随着科学仪器的普及以及计算机技术的发展,仪器分析已经成为当今分析工作中的重要工具。分析仪器昂贵、精密,不同类型的仪器对分析样品有不同的要求,如气相色谱一般要求分析样品为有机相,液相色谱可为水相;紫外光谱分析的液体样品需用不具有紫外吸收的溶剂制备,而红外光谱分析必须排除水的干扰等等。因此仪器分析之前一般需要对样品进行处理。样品前处理方法和仪器测试方法构成了完整的仪器分析方法。

有关样品前处理方法和仪器分析方法见第四章和第五章内容。

第二节定性分析方法

定性分析用于确定检材中含有哪些元素、基团、官能团、成分以及结构等。

一、种属鉴定

种属鉴定也称种类鉴定,用于确定物证检材的种类或是否含有某种成分,如纤维、油漆、助燃剂的种类,毒物、毒品的种类。这类检验一般不需要比对检材,但有时需要标准品。

二、比对鉴定

确定物证检材与特定来源的嫌疑检材是否成分一致。将两种检材在相同的条件下进行检验,根据特征进行比较,确定两者的异同。例如将现场上被撬物上的油漆与嫌疑工具上的油漆进行比对检验,认定两者是否相同。再如确定受害人处提取的纤维与现场或嫌疑人衣物上的纤维是否一致,肇事现场上的油漆与嫌疑车辆上的油漆是否一致等等。这种比对检验的优点在于不需要详细了解物证检材的组成,只需在相同的条件下对两种检材的成分异同进行比较即可。

三、同一鉴定

确定物证检材与嫌疑检材是否“同一”。所谓“同一”是指同一物质、同一来源。这时除了所有比对的成分完全一致外,一般需要其他特征,如剥离特征、断裂特征等的完全匹配。对于物证检验,在理论上很难做到“同一”认定,只能趋于“同一”认定。这一检验是在前两项检验的基础之上进行的。如纸张检验,通过对检材和样本纸张的检验可以认定它们的种类,要确定两者是否同一,还要对纸张的胶料、色料、填料进行检验,必要时还要对制浆方法及一些物理参数以及一些特殊的纸病进行检验,所有的检验完全一致时,才能得出“同一”的认定结论。

第三节定量分析方法

定量分析是在定性分析的基础上,对检材中的成分含量进行测定。几乎所有的分析过程,包括样品制备和测试,都需要用化学标准品进行校正。检测信号和待测物含量之间的关系可以通过已知含量待测物的响应得到;同样,如果涉及样品处理过程,在检材基质中加入已知量的待测物来计算回收率是非常重要的。因此标准品的质量是获得准确定量结果的重要保证。

最常用的定量校正曲线是经典的外标法,内标法,标准加入法。方法的选择取决于分析样品的类型。

一、外标法

外标法(external standardization)又称标准曲线法,是用与检材相同的样品基质(空白样品)制备已知浓度的待测物标准品,在相同的操作条件下分别进行提取和测试,测得响应值,然后绘制响应值与含量关系的校正曲线,典型的标准曲线如图6-1所示。标准曲线的浓度范围应该覆盖检材中可能含有的待测物浓度。该曲线的斜率即为该组分的定量校正因子。之后在相同的条件下提取和测试检材,测得响应值,再从校正曲线上查得含量。此法的优点是操作简单,计算方便。但结果的准确度受提取重复性和操作重复性以及条件稳定性的影响。当检材中待测物浓度变化不大时,可不必绘制标准曲线,而用单点校正法。即配制一个和待测组分含量十分接近的标准溶液提取测试,由待测组分和标准品的响应值比来求得被测组分的含量。此法假定标准曲线是通过坐标原点的直线,因此可由一个标准品浓度及响应值决定校正曲线(实质是决定定量校正因子),因而称之为单点校正法。与之相应,还有两点校正法。

外标法重要的一点是标准品和样品的基质要尽可能接近,并证明待测物在两个基质中的响应相同。

二、内标法

内标法(internal standardization)是选择试样中不含有的标准纯物质作为内标物(internal standard, IS)加入到待测检材中,通过测定被测组分和内标的响应信号比来确定被测组分的含量。首先配制一系列待测组分标准品与内标物(Wi/Ws)浓度比值不同的混合物,分别提取并测试,得到它们的响应值比(Ai/As),然后以待测组分标准品和内标物的响应值比对组分浓度作图,得一校正曲线。称取样品,加入内标物,提取并测试待测组分和内标物的响应比,从校正曲线上查得待测组分浓度(图6-2)。

内标法是通过测量内标物及待测组分的响应比值来进行待测物浓度计算的,因而在提取和测试过程中产生的误差,将同时反映在内标物及待测组分上而得到抵消,因此内标法可以弥补由于基质效应和进样波动所带来的待测物回收率变化和峰面积绝对值的变化。内标法应在检材处理之前把已知量的内标物添加到每一份检材和标准品中。

尽管内标法可以弥补外标定量中的一些误差,但是内标法的应用也面临一些困难。首先选择合适的内标物通常很困难,因为要求内标物必须是很纯的物质并且从来不会出现在检材中;其次,内标物不能干扰待测物的萃取和分析;最后,为便于内标物与待测物有相似的萃取和分析行为,要求内标物与待测物结构相似,否则其补偿作用将会丧失。

三、标准加入法

有些检材是“独特的”(如腐烂或采取防腐措施的检材),因此很难或者不可能获得与检材相似的基质来制备可靠的校正样品。一个有效的方法是采用标准加入法(standard addition),即将已知量的待测物直接加入到检材后再进行分析。在待测物溶液中加入一倍或整倍数的待测物标准品,然后制备校准曲线。如图6-3所示,检材中待测物的浓度可以通过校准曲线推算来确定。对于这种方法,待测物的响应值在校准曲线浓度范围内必须是线性的。标准加入法的具体步骤是把样品平均分成许多份,然后加入递增浓度的标准品,再对这些样品进行分析,绘制峰面积响应值与最后浓度的关系曲线。标准品的最后浓度是指其加入到样品检材中的浓度,因此最初浓度可以在x轴上进行推断。因为待测物的最终浓度(稀释的浓度)是通过待测物的初始浓度表示的,因此可确定待测物的初始浓度。另一方法是制备一个添加样品,通过下式计算待测物初始浓度。

第四节分析方法评价

获得准确分析结果的基础是建立可靠的分析方法。微量物证与毒物毒品分析中,尤其是法庭毒物分析中使用的方法需要严格的方法建立过程,然后是对方法进行严格的评价过程。只有通过评价过程才能客观地说明一个方法是否满足最低接受的标准,反映其内在的质量,从而证明该方法是否可在一定的范围内应用。目前的实验室质量管理和认可体系尤其关注这一点。而且为适应这一需求,通过同行评审的科学期刊对方法评价的要求也正在增多。

一、定性分析要求

对于定性分析,普遍接受的评价参数有选择性和最小检测限(LOD),其他参数如精密度、回收率和适应性也很重要。如果使用LC/MS方法,特别是使用电喷雾离子源(ESI)时,基质效应,即离子抑制和离子增强效应应当作为评价的一个参数。

二、定量分析要求

对于定量分析,普遍接受的规则是必须对一些分析参数,如选择性、线性、稳定性、准确性(偏离)、精确性(重复性)、最小定量限(LLOQ)等进行评价。其他评价参数还有最小检测线(LOD),回收率、重复性和适应性等。

分析方法评价中另一个常提及的问题是方法的不确定度,但不确定度本身不是一个方法评价参数。它与某些评价参数,主要是偏差和精密度有关。

三、评价参数

用于评价分析方法的标准称作性能参数。基于这些参数,人们可以预测这个方法是否满足某种需要,表6-1汇总了这些性能参数、定义以及可接受的结果标准。

表6-1  分析方法性能参数

                                                                                                                               

 

编号

 
 

参数

 
 

定义

 
 

接受标准

 
 

1

 
 

选择性

 
 

区别干扰的能力

 
 

没有信号干扰

 
 

2

 
 

线性范围

 
 

校正曲线的线性范围

 

 

3

 
 

准确度

 
 

与真值的偏差

 
 

正常值的偏差在±15%之内(LLOQ附近为±20%)

 
 

4

 
 

精密度

 
 

平行样本测定的重复性

 
 

精密度为15% RSD(LLOQ附近为20%)

 
 

5

 
 

检测限LOD

 
 

可检测的最低浓度

 
 

符合鉴定标准;或者S/N≥3

 
 

6

 
 

最小定量限LLOQ

 
 

可定量的最低浓度

 
 

在LLOQ点符合准确度和精密度标准,见上;或者S/N≥10

 
 

7

 
 

回收率

 
 

萃取的效率

 
 

可接受的灵敏度、可重复的回收率;≥50%

 
 

8

 
 

适应性

 
 

测定的持久性与在不利条件下操作的能力

 

 

9

 
 

基质效应

 
 

待测物在离子化过程中受到抑制或增强的现象

 

 

9

 
 

分析速度

 
 

样品制备和分析需要的时间

 

 

10

 
 

样品通量

 
 

在给定时间内可分析的样品数量

 

 

11

 
 

是否易于自动化

 
 

体系是否易于实现自动化

 

 

12

 
 

便携性

 
 

设备可移动的能力

 

 

13

 
 

环保性

 
 

废物利用和能源消耗的生态效率

 

 

14

 
 

成本

 
 

设备成本+ 消耗成本+人力成本

 

 

(一)选择性

一般将选择性(selectivity)定义为“分析方法在其他成分可能存在的情况下,准确对待测物进行测定和鉴别的能力。”其他成分可能是代谢物、杂质、降解产物和基质成分等。第一种确定选择性的方法是证明空白基质对待测物没有响应信号,即不存在干扰待测物和内标物的信号。第二种方法是基于一种假设,即在纯粹的定量分析中,只要在LLOQ点的准确性(偏差)和精密度在可接受的数值之内,则可以允许小的干扰。因为在毒物毒品分析中,分析的主要目的是证明是否服用了某种物质,因此定性的数据更为重要,这时证明不存在干扰信号的方法更为合理。

 毒物分析方法的选择性至关重要。过去10年中已经成为惯例的做法是分析至少6个不同来源的空白基质来确定选择性,但是这个数量的空白基质依然会导致很难发现一些不常见的干扰杂质。基于这个原因,又提出了至少要评价10~20个不同来源的空白基质。这一做法保证了即使是很少见的杂质也基本不可能被漏掉,因此在对大量的生物检材进行常规分析时是合理的。

 因为来自毒物的检材经常还会存在不同的毒品、毒物和它们的代谢物,因此确定可能会存在于真实检材中其他物质的干扰也非常重要。可以在空白检材中添加可能存在的最大量的干扰物质来进行这一检查。另一种排除其他毒物和其代谢物干扰的方法是检查含有这些成分但不含有待测物的真实检材。这种方法更易于发现能产生大量代谢物的干扰成分,可保证能排除这些代谢物的干扰,而对于添加纯物质的实验不能反映代谢物的干扰。

 以质谱为基础的方法常使用待测物的稳定同位素标记物做内标(IS),因此可以通过内标质谱离子与待测物离子的比值理想的补偿检材在制备和检测过程中的变化。但是同位素标记的内标也可能含有未标记的杂质,或者它们的质谱图含有与待测物正好相同的质荷比(m/z)碎片离子,这两种情况都会使待测物的峰面积高于真实值,因此影响定量结果的准确性。要证明内标中不含有这样的干扰物,需要分析所谓的“零”检材,即在空白检材中添加内标进行检查。与此类似,待测物也可能干扰同位素标记的内标物的测定。当使用氘代内标时,如果内标物中氘代原子的数目或者监测离子碎片中氘代原子的数目小于3时,问题会很严重。用空白检材添加校准曲线上最高点浓度的待测物,但不加内标,可用于检查是否存在这样的干扰。

一般不允许采用治疗药物作为内标。因为尽管某种药物在某一个国家不使用,但在国际化和全球化的今天不能完全排除它在待分析的检材中不存在。如果出现这种情况,IS的信号会增大,必然会导致检材中待测物的浓度降低。在使用质谱检测时,总是选择同位素标记作为内标,但如果标记的同位素数目很少的话,在一定程度上会增强待测物的信号。

 (二)线性与线性范围

 线性与线性范围(linearity and linearrange)这一参数用于考查检材中待测物的浓度与响应信号(在生化分析方法中,多数为待测物与内标的峰面积比)的关系。线性关系的好坏用相关系数(coefficient)表示。多数情况下,可以接受的相关系数为0.99。但在有些情况下相关系数为0.98 也可作为最低接受标准。

 对生物检材中待测物的分析,通常用生物检材基质制备校正点,即在空白生物检材中添加标准品。校正点呈线性范围内最高浓度与最低浓度的比值称为线性范围。线性曲线的制作多数要求至少要有5~8个浓度点,且每一个浓度点至少要做2到6个重复样品。一般推荐使用少数浓度点但多个平行样品。如果浓度点足够多且平行样品足够多,就会找到充分反映待测物浓度与响应的关系。毒物分析学领域发表的文章多数使用普通的线性方程,即最小平方回归模型。但有时需要使用非线性模型(如二次方)。

(三)准确性

 方法的准确度(accuracy)受系统误差(偏差)以及偶然误差(精密度)的影响。但本文的准确度用来说明偏差。偏差是“实验结果值与真实值之间的差别”,通常用与真实值的偏差百分数表示。

 偏差可以通过在一定的条件下对质控(qualitycontrol,QC)样品进行分析得到。理想的质控样本的来源应该是独立的,不应该由进行方法学认证的人来制备;而且应该使用不同批次的标准品制备。这些操作可更客观地评价在称量、稀释过程中,以及标准品中杂质产生的偏差。

 质控样本至少应当包括线性范围的两个端点浓度,最好也包括中间点。在临床和法医毒物分析中,对高于线性浓度的检材,合理的方法是适当稀释或减少检材体积后再进行定量。生物检材分析中广泛接受的准确度是在真实值的±15%以内,最低检测点时为±20%以内。

(四)精密度

精密度(precision)的定义是“相同的条件下在同一个均匀样品中,数个平行取样的样品测定结果间的相似程度(分散度),通常有三层含义:重现性、中间精密度和重复性。

精密度通常测定的是不精密的程度,用绝对和相对标准偏差(relative standard deviation, R.S.D)来表示,与真实值没有关系。“重现性表示的是在很短的时间内,在相同条件下所得结果的精密度”,重现性也称作实验精密度。同一批次分析和同一日分析的精密度也经常用重现性表示。中间精密度用于描述一个实验室在不同日期、不同人员、不同设备等之间进行分析的结果偏差。重复性(reproducibility)表示不同实验室之间(如合作研究,经常用于方法的标准化过程)的分析结果间的精密度。如果一个方法要在不同的实验室使用,就要考查重复性。有些作者对同一实验室内的实验结果也用重复性表示,而实际上这属于不同环境下的精密度,应当注意避免引起混淆。

精密度和偏差可以通过在一定的条件下对质控(QC)样品进行分析得到。在生物检材分析中广泛接受的标准是:精密度为15% R.S.D.,最低检测点为20% R.S.D.。

有两种精密度数据的表示方法。第一种方法是在重复性和中间精密度的定义条件下,对每个浓度点分别进行5个到10个样品的独立测定,然后通过得到的数据计算这些规定条件下的R.S.D.数值。而对应的偏差为测得的数值与平均值之间偏离的百分数。因此在每一个浓度点下,有2个偏差值,一个是由重复实验(同一天或同一实验)得到的平均值计算的结果,另一个是不同因素的中间精密度(不同天或不同实验运行间)的结果。

在第二个方法中,每个浓度点的平行样品是在许多不同的条件下进行分析的,如8天之内,或在几个连续的实验运行内对每个浓度点进行重复测定。第二种方法可以反映有关分析过程的信息,而且得到的重复性不仅考虑了单个因素而且考虑了数种因素,因此更能反映方法的实际重复性。

目前许多发表的文章将上述方法混淆在一起。因此说明精密度的文章不仅要说明精密度研究采用的实验方法,而且要详细说明结果的计算过程。否则,不同文章中的精密度就不可能进行比较。

(五)定量下限与定量上限

定量下限( lower limit of quantification,LLOQ)是检材中的待测物在满足一定精密度和准确度(偏差)的情况下能够定量测定的最低浓度。LLOQ的测定有不同的方法。第一种方法,也是最实用的方法,是将LLOQ定义为在可接受的精密度和准确度(偏差)条件下可对样品进行定量的最低浓度。在LLOQ点可以接受的两个参数标准是,精密度为20%的RSD;偏差也为20%。第二种方法也是最常用的方法,是基于信噪比(S/N)估算LLOQ数值。S/N定义为待测物峰高(信号)相对于待测物峰附近噪音的比值。对于LLOQ,S/N一般要求大于等于10。第三种估计LLOQ值的方法是在该点浓度下的响应应该大于估计的空白样品SD的k倍,其k值一般为10。该点的浓度可通过该响应值除校正曲线的斜率获得。这种方法只适用于通过空白样品的重复分析可获得空白SD的方法。因此不适用于多数色谱定量方法,因为在这些方法中响应常常用峰面积表示,因此无法对空白样品进行测定。最后一种方法是用待测物标准品建立的校正曲线的最低浓度估计LLOQ值。

定量上限(upper limit of quantification,ULOQ)是检材中的待测物在满足一定精密度和准确度(偏差)的情况下能够定量测定的最高浓度。一般来讲,ULOQ就是标准校正曲线的最高点浓度。

(六)检测限

从定义上看,低于LLOQ的定量结果是不能接受的,因此浓度低于该点时只能给出半定量或定性的结果。然而,尤其是在毒物分析中,了解方法的检测限(limit of detection,LOD)非常重要。LOD的定义是样品中可以被检测到的,但不需要精确定量的待测物的最低浓度,或者是该方法可准确与空白样品区分的检材中待测物的最低浓度。确定LOD的方法基本上与上面讨论的LLOQ的方法相同,只是不需要精密度和准确度的要求。与LLOQ测定不同的是,LOD的S/N或k值是等于或大于3。

(七)回收率

回收率(recovery)是经过检材处理后的待测物响应与对应于 100%回收时溶液中相同浓度的待测物响应的比值。因此如果最后要分析的样品经过了衍生化过程,通常不能计算绝对回收率,因为通常找不到对照样品的衍生化产物。回收率在方法的评价中不是必须要考查的一个参数。多数作者认为,只要LLOQ(LOD)、精密度和准确度(偏差)等参数可以接受,回收率的数值并不重要。但是,有一些标准要求在高和低2个浓度点测定回收率,甚至要求这些回收率应当高于50%。在LC-MS(-MS)分析中,必须测定回收率,因为相对于标准溶液来讲,检材经过处理的溶液会产生基质效应(ME)。因此在LC-MS(-MS)的方法确认中,与离子抑制/增强实验一起进行回收率测定是必要的。

(八)基质效应

基质效应(matrix effect, ME)也称离子抑制或增强效应。LC-MS(-MS)分析中,待测物在离子化过程中由于共流出物而受到抑制或增强的现象已广为人知,这一现象与检材的基质、检材的处理过程、色谱分离的好坏、流动相添加物和电离方式有关。据报道电喷雾电离(ESI)最容易产生这一现象,大气压化学电离(APCI)也会产生这一现象。显然离子抑制以及离子增强效应会影响某些方法评价参数,如LOD、LLOQ、线性、精密度或偏差,后3个参数在没有使用同位素标记的内标时尤其如此。因此离子抑制/增强效应是使用LC-MS(-MS)方法中必须评价的一个参数。文献中有2种方法用于研究离子抑制/增强效应。第一种方法,是用注射泵通过柱后接头将待测物的溶液连续注入到洗脱剂中,结果会在检测器上产生一个恒定的信号,如果柱中流出的化合物有抑制或增强离子化的效应,则检测器的响应信号会相应地受到抑制或增强。第二种方法测定的基本的过程如下,测定待测物在3个不同样品中的峰面积,第一种样品中只有标准品待测物(样品1),第二种样品是对不同来源的空白检材经过萃取后添加标准品待测物(样品2),第三种样品是在相同来源的空白检材中添加标准品待测物后进行萃取(样品3)。依据这些数据,通过样品2的响应与样品1的响应百分数计算基质效应(离子抑制/增强);通过样品3与样品2的响应百分数计算回收率;最后通过样品3的响应与样品1的响应百分数计算所谓的过程效率。

柱后注入实验在方法的建立中非常有用,因为它可提供在哪些保留时间下会产生离子抑制/增强的信息,因此可以通过优化分离体系避免。第二种方法似乎更适合认证,因为它可估计ME的数值及其变化,因而更客观。不管使用哪一种方法进行确认,如上面选择性一节提到的,都有必要评估多个来源的空白基质。

第五节方法评价

 一个新的分析方法或检材处理方法在应用之前必须进行方法评价(methodvalidation)。评价过程需要测试许多性能参数。随机和系统误差通过精密度和偏差测定得到,检测限需要对每一个待测物进行估算。准确度和精密度需要在方法所应用的浓度范围内测定,还要确定线性范围以及校正灵敏度。总之,方法评价为一个新的方法提供了一个反映其综合性能的描述,并为与现存方法进行比较提供了依据。

 一个典型的确认过程包括以下一个或多个程序。

 一、方法评价过程

(一)测定性能参数

测定准确度、精密度、检测限、线性范围和灵敏度。通过不同浓度的标准品进行测定。

(二)分析未知样品

 分析浓度未知的样品,进行定性和定量测定。作为有证参考物质,可靠的未知样品应从商业公司或政府机构获得,需要测定准确性和精密度。

(三)等效实验

一旦方法建立起来,要与已有的类似方法进行比较。通过统计数据确定新方法和老方法是否得到相同的结果。典型的检验包括通过学生t-检验比较均值,通过F-检验比较偏差。

(四)协同实验

 如果一个实验室完成了对方法的认证实验,接下来需要进行的是协同实验。这时,将完全相同的测试样品和操作程序分发到几个实验室,然后对实验结果进行统计确定偏差和实验室间的变异。这一实验测定的是该方法的适应性(稳定性)。

二、方法评价实验设计

表6-1是一个完整的方法评价过程,包括实验内容、评价方法和接受标准。推荐从选择性和离子抑制/增强实验开始进行评价,如果这两个参数中的任意一个不符合要求,则必须对方法进行调整。如果一个方法具有选择性并且不存在基质干扰,则需要评估处理后的样品稳定性,确保在对大批量的样品进行分析时,这些样品在自动样品架上的稳定性。如果处理后的样品稳定,可以继续进行线性实验和校正模型(线性)的评估。当合适的校正模型建立后,早期的评价阶段完成,然后开始主要的评价阶段,包括偏差、精密度以及冷冻/解冻稳定性的评估。

本章小结

微量物证分析的主要作用是定性,根据要求不同可分为种属认定、比对认定和同一认定;毒物毒品分析主要是在定性的基础上进行定量分析,一般采用内标法,特殊情况下采用标准加入法。定量分析中标准品的质量保证至关重要。

分析方法关系到结果的准确,因此新方法需要严格的方法建立过程以及随后的方法评价过程。评价的参数有选择性、线性、稳定性、准确性(偏离)、精确性(重复性)、最小定量限(LLOQ)、最小检测线(LOD),回收率、重复性和适应性等。

思考题

1.什么是定性分析?什么是定量分析?

2.定量分析有哪些方法?各有什么优缺点?

3.什么是内标法?具有什么特点?内标物如何选择?如何使用?

4.为什么要进行方法评价?评价方法的参数有哪些?接受标准是什么?

5.如何进行方法评价?

6.什么是基质效应?如何消除?