第五章  现代仪器分析技术

教学重点与难点:微量物证与毒物毒品分析中常用仪器分析方法的原理、仪器结构、特点、操作、定性定量方法及适用范围。

仪器分析(instrumental analysis)是分析化学的重要组成部分。分析化学是研究分析物质的化学组成、含量和状态方法的理论与实践的一门学科。任何科学研究领域,只要涉及化学现象,分析化学都作为手段参与其中,被誉为科学研究和生产生活活动的“眼睛”。在微量物证与毒物毒品分析中,检材经过样品制备过程之后,一般需要通过各种检测方法进行检测。而仪器分析引进当代科学技术的最新成就,追求高灵敏度、高选择性、高速度、自动化和智能化,已经展现出从常量分析向微量、痕量、超痕量分析,从组成分析向形态分析,从总体分析向表面微区分布、逐层分析,从宏观分析向微观结构分析,从静态分析向快速反应追踪分析,从破坏试样分析向无损分析,从离线分析向在线分析,从生物提取样分析向活体分析,从低速分析向高通量分析转变的态势。

由于仪器检测方法的特性,一般作为实验室检测方法,根据检测原理和作用不同可分为显微分析、光谱分析、质谱分析、色谱分析、电化学分析等。

第一节显微镜


显微镜(Microscope)是借助光学系统或电子光学系统观察物体表面形态的仪器,一般分为光学显微镜和非光学显微镜。光学显微镜包括生物显微镜、立体显微镜、偏光显微镜、比对显微镜、金相显微镜等。非光学显微镜包括扫描电子显微镜、透射电子显微镜、隧道(原子力)电子显微镜等。显微镜的主要功能是通过影像放大提高人的视觉分辨能力,以观察人眼看不到或看不清的物体形态或痕迹。在微量物证分析中,显微镜的应用及其广泛,如纤维、涂料、纸张、塑料、玻璃、泥土等的检验。

一、      光学显微镜

    光学显微镜(Optical Microscope)是利用光学原理,把裸眼不能分辨的微小物体放大成像以获取微细结构信息的光学仪器。

(一)生物显微镜

生物显微镜(biologicalmicroscope)利用透射光照明,观察透明或半透明物体形貌的显微镜。主要用来观察生物样品,如动物、植物、微生物等组织样本的观察研究,也可用于观察其他透明或者半透明物体以及粉末、细小颗粒等物体。

(二)立体显微镜

立体显微镜(stereomicroscope;dissecting microscope)又称实体显微镜,是利用测射光照明,观察不透明物体立体形状或表面结构的显微镜。它将两个功能独立的显微镜光轴以一定的角度——体视角(12°~14°)连接在一起,因此成像具有三维立体感。立体显微镜的特点是立体感强,成像清晰和宽阔,主要用于观察样品的立体形貌结构、工具痕迹,寻找附着物或者借助它来采集物证。高性能的立体显微镜可用来观察研究笔记的交叉顺序问题。

(二)偏光显微镜

偏光显微镜(polarizing microscope;polarizationmicroscope)全称为偏振光显微镜。偏光显微镜与普通生物显微镜的区别在于前者在载物台下装有起偏器,而在物镜与目镜之间装有检偏器。起偏镜和检偏镜的光轴互相垂直。

根据光学性质,可将物质分为各向同性与各向异性两大类。各向同性指物体的物理、化学等方面的性质在不同的方向所测得的性能数值完全相同,亦称均质性。如所有的气体、液体(液晶除外)以及非晶质物体都显示各向同性。而分子高度有序(如晶体)且不对称排列的物质(如“取向”的聚合物)为各向异性物质。各向异性物质具有多种光学性质,如双折射。凡具有双折射性的物质,可用偏光显微镜分辨,如晶体、纤维、玻璃、木材、矿石、泥土等。一些在普通显微镜下看起来相同的样品,在偏光显微镜下可显示出差异。

微量物证检验中常见的纤维和薄膜由于制造过程的拉伸或应变造成了取向性,因此偏光显微镜是检验纤维和聚合物薄膜的重要仪器。此外,有些各向同性物质经热处理后也会变成各向异性物质。如普通玻璃是典型的各向同性物质,但经淬火处理制成钢化玻璃后,则转变成各向异性物质,具有双折射性质。因此可用偏光显微镜对普通玻璃和钢化玻璃进行区分,还可对不同的钢化玻璃进行检验。

(三)比较显微镜

比较显微镜(comparison microscope)是两个并排放置的显微镜通过同一个视野对两个物体同时进行观察、比较的显微镜。通常有两个物镜、一个目镜、两组照明系统和两个载物台组成。观察时,两个比较样品置于同一水平面、光照度和角度下。比较显微镜主要用于检材与比对样本间共性与差异点的比较检验,如印刷品、字迹、券币、纤维、工具痕迹、枪弹痕迹等的比较检验,高级的仪器可以对痕迹进行对接和重影比较观察。

(四)金相显微镜(metallurgical microscope)

金相显微镜(metallurgical microscope)专门用于观察金属及合金金相结构的显微镜。它用较强的光源由正面和侧面照射样品,由光学系统接收反射光。金属与合金的性质和性能,如机械性能(强度、硬度、塑性)、物理性能(导电、导热、抗磁)、化学性能(耐腐蚀、抗氧化等)及工艺性能(铸造性、焊接性、冷热加工等),都可以通过金相形态来反映。例如,热处理方式不同的同型号钢材,可由金相组织来鉴别;材料断裂、缺陷造成的损伤也可用金相显微镜来观察分析。用于金相显微镜观察的样品,表面必须非常光滑,因此观察前首先要对样品进行磨光和腐蚀处理。

二、电子显微镜

电子显微镜(electron microscope)简称电镜,是根据电子光学原理,用电子束和电子透镜代替光束和光学透镜,使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。电子显微镜常用的有透射电镜和扫描电子显微镜

(一)扫描电镜

扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope,SEM)依据电子与物质的相互作用测试被测样品的各种物理、化学性质,如形貌、组成、晶体结构、电子结构和内部电场或磁场等。

1.扫描电镜的构成。(1)电子光学系统。电子光学系统由电子枪、电磁透镜(线圈)、物镜、样品室等部件构成,作用是将电子流调节成高亮度、小束斑的高能电子束轰击样品,产生各种物理信号。

(2)扫描系统。扫描系统由扫描线圈、扫描发生器组成,作用是使高能电子束在样品上扫描并同步调制阴极射线显像管电子束在荧光屏上扫描,调节扫描振幅以改变放大倍率。

(3)信号收集系统。信号收集系统由闪烁体、光导管、光电倍增管组成,作用是收集电子信号并转变成光信号,再增益放大成可调制图像的电信号。

2.扫描电镜工作原理。

扫描电镜是靠电子衍射成像。用电子光学系统调制的极细高能电子束在样品表面扫描,激发样品,使之产生一系列物理信号,如二次电子、背散射电子、吸收电子、X射线等。其中二次电子和背散射电子的信号强度随样品表面形态改变,用相应的探头将信号接收放大并运送到显像管,在荧光屏上可显示样品表面的立体构像,可摄制成照片。如果配以X射线能谱仪,还可以进行元素定性和定量分析。

(二)透射电镜

透射式电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)因电子束穿透样品后再用电子透镜成像放大而得名。它的光路与光学显微镜相仿,可以直接获得一个样本的投影。在这种电子显微镜中,图像细节的对比度是由样品的原子对电子束的散射形成的。由于电子需要穿过样本,因此样本必须非常薄。组成样本的原子的原子量、加速电子的电压和所希望获得的分辨率决定样本的厚度。样本的厚度可以从数纳米到数微米不等。原子量越高、电压越低,样本就必须越薄。样品较薄或密度较低的部分,电子束散射较少,因此就有较多的电子通过物镜光阑,参与成像,在图像中显得较亮。反之样品中较厚或较密的部分,在图像中则显得较暗。如果样品太厚或过密,则像的对比度就会恶化,甚至会因吸收电子束的能量而被损伤或破坏。

    三、原子力显微镜

原子力显微镜(atomic force microscope,AFM),也称扫描力显微镜(scanning force microscopy,SFM))是一种可用来研究包括绝缘体在内的固体材料表面结构的分析仪器。

(一)原子力显微镜原理

原子力显微镜通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。将一个对微弱力极敏感的微悬臂一端固定,另一端有一微小的针尖,针尖与样品表面轻轻接触,由于针尖尖端原子与样品表面原子间存在极微弱的排斥力,扫描时控制这种力的恒定,则带有针尖的微悬臂对应于针尖与样品表面原子间作用力的等位面在垂直于样品的表面方向做起伏运动。利用光学检测法或隧道电流检测法,可测得微悬臂对应于扫描各点的位置变化,从而可以获得样品表面形貌的信息。其与扫描隧道显微镜(STM)最大的差别在于并非利用电子隧穿效应,而是检测原子之间的接触、原子键合、范德华力或卡西米尔效应等来呈现样品的表面特性。

(二)原子力显微镜的结构

原子力显微镜系统可分成三个部分:力检测部分、位置检测部分和反馈系统。

 1.力检测部分。在原子力显微镜系统中,所要检测的力是原子与原子之间的范德华力。因此使用微小悬臂来检测原子之间力的变化量。微悬臂通常由一个一般100μm~500μm长和大约500μm~5μm厚的硅片或氮化硅片制成。微悬臂顶端有一个尖锐针尖,用来检测样品-针尖间的相互作用力。这微小悬臂有一定的规格,例如:长度、宽度、弹性系数以及针尖的形状,而这些规格的选择是依照样品的特性,以及操作模式的不同,而选择不同类型的探针。

2.位置检测部分。当针尖与样品之间有了交互作用之后,会使得悬臂摆动,所以当激光照射在微悬臂的末端时,其反射光的位置也会因为悬臂摆动而有所改变,这就造成偏移量的产生。在整个系统中是依靠激光光斑位置检测器将偏移量记录下并转换成电的信号,以供控制器作信号处理。

3.反馈系统。信号经由激光检测器取入之后,在反馈系统中会将此信号当作反馈信号,作为内部的调整信号,并驱使通常由压电陶瓷管制作的扫描器做适当的移动,以保持样品与针尖保持一定的作用力。

原子力显微镜(AFM)是结合以上三个部分将样品的表面特性呈现出来:使用微小悬臂(cantilever)来感测针尖与样品之间的相互作用,这作用力会使微悬臂摆动,再利用激光将光照射在悬臂的末端,当摆动形成时,会使反射光的位置改变而造成偏移量,此时激光检测器会记录此偏移量,也会把此时的信号给反馈系统,以利于系统做适当的调整,最后再将样品的表面特性以影像的方式给呈现出来。

(二)原子力显微镜的工作模式

原子力显微镜的工作模式是以针尖与样品之间的作用力的形式来分类的。主要有以下3种操作模式:接触模式、非接触模式和敲击模式。

1.接触模式。接触模式(contact mode)是AFM最直接的成像模式。正如名字所描述的那样,AFM 在整个扫描成像过程之中,探针针尖始终与样品表面保持紧密的接触,而相互作用力是排斥力。扫描时,悬臂施加在针尖上的力有可能破坏试样的表面结构,因此力的大小范围在10 - 10 N~10 - 6 N。若样品表面柔嫩而不能承受这样的力,便不宜选用接触模式对样品表面进行成像。

该模式扫描速度快,是唯一能够获得“原子分辨率”图像的AFM垂直方向上有明显变化的质硬样品。缺点是横向力影响图像质量。在空气中,因为样品表面吸附液层的毛细作用,使针尖与样品之间的粘着力很大。横向力与粘着力的合力导致图像空间分辨率降低,而且针尖刮擦样品会损坏软质样品(如生物样品,聚合体等)。

2.非接触模式。非接触模式(non - contact mode)探测试样表面时悬臂在距离试样表面上方5nm~10nm的距离处振荡。这时样品与针尖之间的相互作用由范德华力控制,通常为10 - 12 N ,样品不会被破坏,而且针尖也不会被污染,特别适合于研究柔嫩物体的表面。这种操作模式的不利之处在于要在室温大气环境下实现这种模式十分困难。因为样品表面不可避免地会积聚薄薄的一层水,它会在样品与针尖之间搭起一小小的毛细桥,将针尖与表面吸在一起,从而增加尖端对表面的压力。通常仅用于非常怕水的样品,吸附液层必须薄,如果太厚,针尖会陷入液层,引起反馈不稳,刮擦样品。因此使用受到限制。

3.敲击模式。敲击模式(tappingmode)介于接触模式和非接触模式之间,是一个杂化的概念。悬臂在试样表面上方以其共振频率振荡,针尖仅仅是周期性地短暂地接触/ 敲击样品表面。这就意味着针尖接触样品时所产生的侧向力被明显地减小了。因此当检测柔嫩的样品时,AFM的敲击模式是最好的选择之一。一旦AFM开始对样品进行成像扫描,装置随即将有关数据输入系统,如表面粗糙度、平均高度、峰谷峰顶之间的最大距离等,用于物体表面分析。同时,AFM 还可以完成力的测量工作,测量悬臂的弯曲程度来确定针尖与样品之间的作用力大小。

该模式很好的消除了横向力的影响。降低了由吸附液层引起的力,图像分辨率高,适于观测软、易碎、或胶粘性样品,不会损伤其表面缺点是比接触模式的扫描速度慢

   (四)原子力显微镜的应用

    原子力显微镜是继扫描隧道显微镜之后发明的一种具有原子级高分辨的新型仪器,可以在大气和液体环境下对各种材料和样品进行纳米区域的物理性质包括形貌进行探测,或者直接进行纳米操纵;现已广泛应用于半导体、纳米功能材料、生物、化工、食品、医药研究和科研院所各种纳米相关学科的研究实验等领域中,成为纳米科学研究的基本工具。原子力显微镜与扫描隧道显微镜相比,由于能观测非导电样品,因此具有更为广泛的适用性。当前在科学研究和工业界广泛使用的扫描力显微镜(Scanning Force Microscope),其基础就是原子力显微镜。

    相对于扫描电子显微镜,原子力显微镜具有许多优点。电子显微镜只能提供二维图像,AFM可提供真正的三维表面图。同时,AFM不需要对样品的任何特殊处理,如镀铜或碳,这种处理对样品会造成不可逆转的伤害。第三,电子显微镜需要运行在高真空条件下,原子力显微镜在常压下甚至在液体环境下都可以良好工作。这样可以用来研究生物宏观分子,甚至活的生物组织。但和扫描电子显微镜,AFM成像范围小,速度慢,受探头的影响大。

第二节光谱分析

    根据电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系所建立起来的一类仪器分析方法,统称为光学分析法。任何光学分析法均包含三个主要过程:能源提供能量;能量与被测物之间的相互作用;产生检测信号。光谱分析法在研究物质组成、结构表征、表面分析等方面具有其他方法不可取代的地位;

一、光谱与物质的相互作用

(一)电磁辐射(电磁波)

在空间传播着的交变电磁场即电磁波。它在真空中的传播速度约为30万千米/秒。电磁波包括的范围很广。实验证明,无线电波、红外线、可见光、紫外线、X射线、γ射线都是电磁波。它们的区别仅在于频率或波长有很大差别。光波的频率比无线电波的频率要高很多,波长比无线电波的波长短很多;而X射线和γ射线的频率则更高,波长则更短。为了对各种电磁波有个全面的了解,人们按照波长或频率的顺序把这些电磁波排列起来,这就是电磁波谱。电磁辐射具有波动性和微粒性。

光的波动性用波长λ、波数σ和频率ν作为表征;光的微粒性用每个光子具有的能量E作为表征。光子的能量与频率成正比,与波长成反比。

         c =λν =ν/σE = hν =h c /λ

c:光速;λ:波长;ν:频率;σ:波数;E :能量; h:普朗克常数

(二)电磁辐射与物质的相互作用

电磁辐射与物质的相互作用是普遍发生的复杂的物理现象,有涉及内能变化的吸收、产生荧光、磷光和拉曼散射等,以及不涉及物质内能变化的透射、折射、非拉曼散射、衍射和旋光等。

当辐射通过固体、液体或气体等透明介质时,电磁辐射的交变电场会导致介质分子(或原子)内部能级的跃迁。如果入射的电磁辐射能量正好与介质分子(或原子)基态与激发态之间的能量差相等,介质分子(或原子)就会选择性地吸收这部分辐射能,从基态跃迁到激发态(激发态的寿命很短,约10-8s),处于激发态的分子(或原子)通常以热的形式释放能量,回到基态。在某些情况下,可发生化学变化(光化学反应),或以荧光及磷光的形式发射出所吸收的能量并回到基态。如果入射的电磁辐射能量与介质分子(或原子)基态与激发态之间的能量差不相等,则电磁辐射不被吸收,分子(或原子)极化所需的能量仅被介质分子(或原子)瞬间(10-14 s~10-15s)保留,然后再被发射,从而产生光的透射、非拉曼散射、反射、折射等物理现象。


二、光谱方法的分类

按辐射与物质相互作用性质,光谱分为吸收光谱、发射光谱与散射光谱(拉曼散射谱)等。 

吸收光谱与发射光谱按发生作用的物质微粒不同可分为原子光谱和分子光谱。由于吸收光谱与发射光谱的波长与物质微粒辐射跃迁的能级能量差相应,而物质微粒能级跃迁的类型不同,能级差的范围也不同,因而吸收或发射光谱波长范围(谱域)不同.据此,吸收或发射光谱又可分为红外、紫外、可见光谱、X射线谱等。




三、原子光谱


原子光谱(atomicspectrometry)是由原子中的电子在能量变化时所发射或吸收的一系列光所组成的光谱。原子光谱的不连续表明了电子的能量是量子化的,对原子光谱的研究是探索原子核外电子排布的重要手段之一。


(一)原子发射光谱


原子发射光谱(atomicemission spectrometry,AES)是利用物质在一定条件激发下,依据不同原子或离子发射的特征光谱对待测物中的元素进行定性与定量分析的方法。


1.原子发射光谱分析原理。通常情况下,原子处于基态。基态原子受到激发跃迁到能量较高的激发态。激发态原子不稳定,平均寿命为10-8秒。激发原子跃迁回到低能态或基态,同时释放出多余的能量,如果以辐射的形式释放能量,该能量就是释放的光子的能量。释放的光子能量等于电子发生跃迁的两能级的能量差,因此发射谱线具有特征频率或特征波长,可根据被测试样原子被激发后发射的特征谱线来测定物质的元素组成。


2.原子发射光谱仪。原子发射光谱仪主要包括激发、分光和检测三个步骤。激发光源的主要作用是为试样蒸发和激发提供所需的能量,使气态原子的外层电子受激发射出特征光谱。主要有火焰、直流电弧、交流电弧、电火花、等离子体、辉光、激光微探针等光源。最常用的是电弧、火花和电感耦合等离子体焰炬(ICP)光源。分光系统的作用是采用色散原件对激发光源发射的辐射进行分光,并通过谱线记录装置获得原子发射光谱。分光系统根据所采用的色散原件分为棱镜光谱仪和光栅光谱仪,根据光谱接收记录方式分为摄谱仪和光电直读光谱仪。


3.电感耦合高频等离子体光源。电感耦合高频等离子体((inductively coupled plasma,ICP)光源是利用高频感应加热原理使流经石英管的工作气体电离而产生火焰状等离子体,被认为是原子发射光谱最有发展前途的光源之一。近代物理学中把电离度大于0.1%的电离气体称为等离子体,由电子、离子、原子和分子组成,其中的电子数和离子数基本相等,宏观上呈现电中性。




ICP-AES一般由高频发生器、等离子体炬管和雾化器组成。样品经雾化器雾化成气溶胶,充分汽化后脱去溶剂,干燥的气溶胶由载气送入等离子体炬进行蒸发、原子化和激发,最后由摄谱仪或光电直读光谱仪记录光谱。


ICP光源中的等离子体炬管由三层同心石英管构成,三层石英管均通入Ar气:最外层Ar气为冷却气,沿切线方向引入并螺旋上升,它既是维持ICP的工作气流,又可将等离子体吹离外层石英管的内壁,防止石英管烧融;中层Ar气为辅助气体,帮助雾化的载气由入口导入,起维持等离子体的作用;内层Ar气为载气,把经过雾化器的试样溶液以气溶胶形式引入到等离子体中。三层同轴石英炬管置于高频感应线圈内,当高频发生器接通电源后,高频电流通过感应线圈产生交变磁场。


开始时管内为Ar气,不导电,需要用高压电火花触发使气体电离;在高频交流电场的作用下,带电粒子高速运动,碰撞,形成“雪崩”式放电,产生等离子体气流;在垂直于磁场方向将产生感应电流(涡电流),其电阻很小,电流很大(数百安),产生的高温又将气体加热、电离,在管口形成稳定的等离子体焰炬。


ICP光源工作温度高,在等离子体焰核处,温度可达10000K,中央通道的温度为6000K ~8000K,且处于惰性气氛条件下,原子化条件优良,有利于难熔化合物的分解和元素的激发,因此对大多数元素都有很高的分析灵敏度。因为高频感应电流具有“趋肤效应”,涡电流在外表面处密度大,使表面温度高,轴心温度低,中心通道进样对等离子的稳定性影响小,也有效地消除了自吸现象,线性范围可达4~5个数量级;ICP中电子密度大,使碱金属电离造成的影响小;Ar气体产生的背景干扰小;且因为无电极放电,不存在电极污染等问题。


4.原子发射光谱应用。根据谱线的特征频率和特征波长可以进行定性分析。常用的光谱定性分析方法有铁光谱比较法和标准试样光谱比较法。原子发射光谱的谱线强度与试样中被测组分的浓度c成正比。据此可以进行光谱定量分析。


光谱定量分析所依据的基本关系式是


I=acb


式中a为比例系数(与蒸发、激发过程等有关);b是自吸收系数,b随浓度c增加而减小,当浓度很小,自吸消失时,b=1。为了补偿因实验条件波动而引起的谱线强度变化,通常用分析线和内标线强度比对元素含量的关系来进行光谱定量分析,称为内标法。常用的定量分析方法是标准曲线法和标准加入法。


原子发射光谱分析的特点是灵敏度高、分析速度快、试样消耗少(mg级)、可进行多元素同时测定。适用于微量样品和痕量无机物组分分析,广泛用于金属、矿石、合金、和各种材料中无机元素成分的分析检验。


(二)原子吸收光谱


原子吸收光谱法(atomicabsorption spectroscopy,AAS) 是通过测量气态原子对特定光辐射的吸收强度对元素进行定量的分析方法,


1.原子吸收光谱分析原理。当辐射投射到原子蒸气上时,如果辐射波长对应的能量等于原子由基态跃迁到激发态所需要的能量时,则会引起原子对该辐射的吸收,产生吸收光谱。基态原子吸收了能量,最外层的电子产生跃迁,从低能态跃迁到激发态。原子由基态跃迁到第一激发态时所产生的吸收线称为共振吸收线,简称共振线。从基态到第一激发态的跃迁最容易发生,因此对大多数元素来说,共振线是元素的最灵敏线。


原子吸收光谱法是基于从光源辐射出具有待测元素特征波长的光(共振发射线),通过试样蒸汽时,被蒸汽中待测元素的基态原子吸收,依据特征光被吸收的程度来测定待测元素的含量。


在热力学平衡条件下,激发态原子数和基态原子数的分布遵循Boltzmann分布定律



式中,Nj和N0分别为激发态和基态的原子数;Pj和P0分别为激发态和基态的统计权重;Ej和E0分别为激发态和基态的电位;T为绝对温度;K为Boltzmann常数。




在原子化温度范围内,大多数元素的激发态和基态原子数的比值Nj/Ni远小于1%,因此可以近似地把参与吸收的基态原子数看做原子总数。


设频率为ν、强度为I0的一束平行光通过厚度为b的原子蒸气时,被原子吸收后的透射光强度Iv可用下式表示


Iv=I0e-Kvb


式中,Kv为基态原子对频率为ν的光的吸收系数,与吸收物质的性质及入射光的频率有关。将Iv和Kv与ν作图,可得吸收线及吸收系数轮廓图




在吸收轮廓的范围内,将吸收系数Kv对频率积分称为积分吸收,表示吸收的全部能量。根据爱因斯坦理论推导,积分吸收与基态原子数成正比,只要测得积分吸收即可求得产生吸收的基态原子数,获得定量结果。但由于积分吸收得测定难以实现,因此提出采用锐线光源,通过峰值吸收代替积分吸收来解决原子吸收测量的难题。




采用锐线光源时,可用峰值吸收系数K0代替Kv,而K0与基态原子数目成正比。因此可得出:




 


所以


A=lg(IO/I)=K' c


即在一定的实验条件下,吸光度A与试样中待测物的浓度C成正比,此即原子吸收光谱法的定量基础。


    2. 原子吸收光谱仪。原子吸收光谱仪由光源、原子化系统、分光系统和检测系统组成。光源为待测元素的空心阴极灯。空心阴极灯用待测元素作阴极,施加适当电压时,电子从空心阴极内壁流向阳极,与充入的惰性气体碰撞使之电离,产生正电荷,其在电场作用下,向阴极内壁猛烈轰击,使阴极表面的金属原子溅射出来,溅射出来的金属原子再与电子、惰性气体原子及离子发生撞碰而被激发,于是阴极内辉光中便出现了阴极物质的发射光谱,即待测元素的特征共振线。其发射线宽度远远小于吸收线宽度,满足峰值吸收测定的条件。该发射线通过试样蒸气时被蒸气中待测元素基态原子所吸收,因此由辐射特征谱线光被减弱的程度可测定试样中待测元素的含量。


3. 原子吸收光谱法的应用。因原子吸收光谱仪的灵敏、准确、简便等特点,现已广泛用于冶金、地质、采矿、石油、轻工、农业、医药、卫生、食品及环境监测等方面的常量及微痕量元素的定量分析。


(三)X射线荧光光谱


X射线荧光光谱(X-Ray fluorescence spectrometry,XRF)是依据物质中的原子受到高能辐射激发后,放射出该原子所具有的特征X射线而进行定性和定量分析的方法;。


1.X射线荧光分析原理。当原子受到X射线光子(原级X射线)或其他微观粒子的激发使原子内层电子电离而出现空位,原子内层电子重新配位,较外层的电子跃迁到内层电子空位,并同时放射出次级X射线光子,此即X射线荧光。较外层电子跃迁到内层电子空位所释放的能量等于两电子能级的能量差,因此,X射线荧光的波长对不同元素是特征的。通过特征X射线可进行元素定性分析,测定其强度可进行定量分析。


2.X射线荧光分析仪。X射线荧光光谱仪主要由激发、色散、探测、记录及数据处理等单元组成。根据色散方式不同,X射线荧光分析仪分为X射线荧光光谱仪(波长色散)和X射线荧光能谱仪(能量色散)。X射线荧光能谱仪没有复杂的分光系统,结构简单。X射线激发源可用X射线发生器,也可用放射性同位素。能量色散用脉冲幅度分析器,探测器和记录等与X射线荧光光谱仪相同。






3.X射线荧光光谱法的应用。X射线荧光光谱具有重现性好、测量速度快、灵敏度高的特点。能分析F(9)~U(92)之间所有元素。样品可以是固体、粉末、熔融片、液体等,适用于金属、水泥、陶瓷、石油、玻璃等样品。无标半定量方法可以对各种形状样品进行定性分析,并能给出半定量结果,分析速度快。


(四)   X射线衍射


X射线衍射方法(x-ray diffraction)是将晶体作为X射线的空间衍射光栅,利用衍射原理,精确测定物质的晶体结构、织构及应力,对物质进行物相分析、定性分析、定量分析的方法。


1.X射线衍射分析原理。当一束单色X射线入射到晶体时,由于晶体是由原子规则排列成的晶胞组成,因此由不同原子散射的X射线相互干涉,在某些特殊方向上产生强X射线衍射,衍射波叠加的结果使得射线的强度在某些方向上增强、而在其它方向上减弱。衍射线在空间分布的方位和强度,与晶体结构密切相关。通过衍射特征可确定晶体结构。


晶体衍射符合布拉格定律

2d sinθ=nλ


式中,λ为X射线的波长,θ为入射角的余角,又称为布拉格角,d为点阵平面间距, n为衍射级数,为任何正整数。

当X射线以掠角θ入射到某一具有d点阵平面间距的原子面上时,如果满足布拉格方程,会在反射方向上获得一组因叠加而加强的衍射线。因为晶面间距一般为物质的特有参数,测定d值及与其相对应的衍射线相对强度,可对物质进行鉴定。


2.X射线衍射仪基本结构。X射线衍射仪一般由X射线发生器、衍射测角仪、辐射探测器和控制系统组成。X射线管发射的X射线照射到样品产生衍射现象,用辐射探测器接收衍射线的X线光子,经测量电路放大处理后,在显示或记录装置上给出精确的衍射线位置、强度和线性等衍射数据,这些衍射数据就是各种实际应用的基础。


3.X射线衍射方法的应用


利用晶体对X射线的衍射效应,可研究晶体的内部结构,最终确定出原子的排列方式,因此可对物质的晶体结构进行研究。该方法是研究粘土矿物的重要手段,能对泥、页岩中自生矿物和碎屑矿物做定量分析;可用于固体有机质的显微结构与变质程度的研究。金属X射线分析已成为金属研究和材料测试的常规方法。根据样品中某一物相的衍射强度可对其含量进行测定,这种物相定量分析是其它方法,如元素分析、成分组分分析等所不能替代的。


四、分子光谱



分子光谱(molecularspectrometry)基于物质分子与电磁辐射作用时,物质分子内部发生了量子化的能级之间的跃迁,通过测量由此产生的反射、吸收或散射辐射的波长和强度而进行分析的方法,称为分子光谱分析法。如紫外可见分光光度法、分子荧光光谱法、红外及拉曼光谱法、核磁共振波谱法等。分子光谱比原子光谱复杂,这是因为分子中除了有电子运动外,还有组成分子的各原子间的振动以及分子作为整体的转动。分子中这三种不同的运动状态都对应有一定的能级,且这三种不同的能级都是量子化的(图5-12)。当分子吸收一定能量的电磁辐射时,分子就由较低的能级跃迁到较高的能级,吸收辐射的能量与分子的这二个能级差相等。其中电子能级的能量差一般为1 eV~20eV(1250 nm~60nm),相当于紫外、可见和部分近红外光的能量;振动能级之间的能量差一般比电子能级差要小10倍左右,在0.05eV~1eV(25000 nm~1250nm),相当于红外光的能量;转动能级之间的能量差一般为0.005 eV~0.05eV(250μm~25μm),比振动能级要低10到100倍之多,相当于远红外至微波的能量。实际上只有用远红外光或微波照射分子时才能得到纯粹的转动光谱;无法获得纯粹的振动光谱和电子光谱。因为在发生电子能级和振动能级跃迁时,会伴有振动和转能级的跃迁,形成所谓的带状光谱。




图5-5分子中电子能级、振动能级和转动能级示意图


(一)紫外-可见光谱


紫外-可见吸收光谱(ultraviolet spectrometry,  UV)是依据物质的分子或离子对紫外和可见光的吸收所产生的紫外可见光谱及吸收程度对物质的组成、含量和结构进行分析的方法。


1.紫外-可见光谱法分析原理。当用具有连续紫外-可见光(200nm~800nm)照射物质时,该物质分子中的电子将发生能级跃迁,从而选择性地吸收某些波长的光,使透过光的强度发生变化。吸收的波长和强度与物质的种类有关。通过吸光度随波长变化的曲线,即吸收光谱图、最大吸收波长(λmax)或最大吸收系数(εmax)可对物质进行定性分析;依据朗伯-比尔定律,波长一定时,通过吸光度和物质浓度之间的关系可进行定量分析。


紫外-可见吸收光谱与分子结构有关,具有共轭双键的有机化合物,随着共轭双键数目的增多,化合物的最大吸收波长发生红移(向长波方向移动),同时吸收强度增加。因此紫外可见光谱适于对具有共轭双键结构的有机物进行定性和定量分析。


定量分析依据朗伯-比尔定律


A= e b c


式中A为吸光度,e为摩尔吸收系数,b为吸收光程,C为待测组分的浓度


定量时,e为一常数。因为e是随波长变化的参数,e~λ关系曲线与A~λ关系曲线形状一致,因此定量分析需在特定波长下进行。一般根据吸收曲线选择最大吸收波长(λmax)进行测定,此时对应的e是最大值(εmax)值,灵敏度最高,且因为处于曲线极值处,波长变化最小,测定误差也最小。


2.紫外-可见光谱仪。紫外-可见光谱仪主要由光源、单色器、样品池(吸光池)、检测器、记录装置组成。光源即辐射源,提供电子跃迁所需要的能量。常用的光源有氘灯(180nm~375nm)和钨灯(330nm~2500nm);单色器的作用是将来自光源的复合光分解为单色光,并能调制出任意所需波长单色光的装置;检测器是一种光电转换装置,将光信号转变成电信号,常用的有光电管以及二极管阵列检测器。


紫外可见光谱仪主要有单光束光谱仪、双光束光谱仪、和双波长光谱仪。


3.紫外-可见光谱法的应用。紫外可见光谱法可用于物质的鉴定及结构分析,也可用于组分的含量测定。其中定性分析是根据光谱吸收峰的数目、峰位、强度、峰形等特征进行物质种类和结构的鉴定,推断分子骨架、判断发色团之间的共轭关系,估计共轭体系长短和取代基的种类、数目、位置等。紫外可见光谱法主要用于定量分析,广泛应用与药物、毒物、染料等的测定。常用的方法有绝对法、标准对照法、标准曲线法和标准加入法。


(二)荧光光谱


荧光光谱(fluorescencespectrometry)是通过测量某些物质被紫外光照射激发后产生的荧光光谱和强度进行定性定量分析的方法。


1.荧光光谱法基本原理。分子荧光分析法的基础是分子从第一激发态的最低振动能级跃迁到基态各个振动能级而产生的发光现象。能够发出荧光的物质称荧光物质。荧光物质只有吸收了激发光后,才能发出具有特征波长的荧光。因此荧光物质具有吸收紫外-可见光的结构特征,并且吸收的能量能以荧光辐射的形式、而不是以非辐射的形式释放出来,既具有较高的荧光产率。一般具有刚性共轭平面结构的分子具有荧光特性。


2.荧光光谱仪。荧光光谱仪包括四个基本组成部分,即激发光源、单色器、样品池和检测器。各部分的基本构件与紫外光谱仪相同,不同的是采用的光源强度大,高压氙灯(250 nm~700nm)是目前荧光光谱仪普遍使用的激发光源。同时为了消除光源透射光的影响,荧光检测器与激发光源成垂直角度。


3.荧光光谱法应用。荧光光谱具有两个特征光谱:激发光谱和荧光光谱。荧光光谱与激发光的波长无关,只反映分子结构。通过测定化合物的荧光光谱,能够进行定性和结构分析。在一定的条件下,某一波长下的荧光强度与样品的浓度成正比,是进行荧光定量的依据。


根据被粗物质本身是否发射荧光,荧光光谱法可分为直接测定和间接测定两大类。对本身能产生较强荧光的物质,如芳香族化合物,可直接测定。对本身荧光很弱或不发荧光的物质,需借助荧光试剂将其转变为能发荧光的物质再进行测定,这种方法称为间接荧光法,也叫做外源荧光法或荧光探针技术。许多金属都可以与一些有机化合物生成金属络合物而产生荧光进行荧光法测定。这样的有机化合物称为荧光试剂,常用的荧光试剂有罗丹明、荧光素、荧光胺、吖啶等。


(三)红外光谱


红外光谱(infraredabsorption spectroscopy,IR)是利用分子中基团的振动-转动能级跃迁产生的光谱而对有机化合物进行结构分析的方法。


1.红外光谱法分析原理。物质在红外光的辐射下,其分子将发生振动能级的跃迁,从而对入射光产生吸收。分子的振动可以看作是构成分子的各种化学键在其平衡位置的振动。由于化学键的种类不同(单键、双键、三键等)以及化学键两端连接的原子或基团不同,因此其基本振动频率不同。当化学键正负电荷中心不重合具有偶极矩时,则振动时会产生偶极矩的交替变化。如果这种偶极矩交替变化的频率与光辐射的频率相同,此时该分子就会吸收该频率的光,从基态振动能级跃迁到较高能级,产生红外吸收光谱。


2.红外光谱仪。红外光谱仪由光源、样品室、单色器、检测器和计算机组成。目前商品红外光谱仪有色散型红外光谱仪和傅立叶变换红外光谱仪两大类。二者的区别在与前使用光栅为色散元件,后者的单色器为迈克尔逊干涉仪。


红外光谱仪的光源是由惰性固体,如锆、钇、铈或钍等氧化物烧结制成的能斯特灯或以碳化硅烧结成的硅碳棒。它们经电加热后能发出高强度的连续的红外辐射供样品吸收。红外检测器多为热检测器,通过吸收红外辐射产生热效应来改变检测器的某些物理特性。目前常用高真空热电偶、热释检测器以及锑镉汞检测器。


由于玻璃、石英等材料几乎可以全部吸收红外线,因此红外光谱仪的样品池一般为NaCl、KBr等可透过红外线的材料。固体样品通常与KBr混合压片,然后直接置于光路中进行测定。红外显微光谱仪是以高压金刚石池为采样装置,所需样品量很少。


3.红外光谱仪的应用。根据化合物的红外光谱特征谱带可确定化合物含有的官能团,进行结构确定。因为红外光谱的特征性强,可以通过两个样品的红外光谱比对确定两者的异同,在微量物证检验方面有很广泛的应用。如分析现场和有关场所客体上提取下来的各种有机物证,包括油漆、塑料、橡胶、纤维、胶黏剂、化妆品、油脂、纸张、可燃物、爆炸物的比对分析。


(四)拉曼光谱


拉曼光谱(Ramanspectroscopy)是利用光散射現象、以拉曼效应为基础建立起来的分子结构表征技术。与红外光谱相同,其信号来源于分子的振动和转动。


1.拉曼光谱分析原理。拉曼光谱是一种散射光谱。当光照射到物质上时,光子与物质分子碰撞,可发生弹性碰撞和非弹性碰撞。弹性碰撞没有能量交换,光子仅改变了方向,基于弹性碰撞产生的散射为瑞利散射;在非弹性碰撞中,光子不仅改变了运动方向,而且与分子进行了能量交换。如果把一部分能量给予了分子,则散射光的频率就会小于入射光的频率;如果从分子处得到能量,则散射光的频率机会大于入射光的频率。这种散射称为拉曼散射,入射光与散射光的频率差称为拉曼位移。用激光作为光源的拉曼光谱称为激光拉曼光谱(laser Raman spectroscopy)。


2.拉曼光谱仪。拉曼光谱仪有色散拉曼光谱仪和傅立叶变换拉曼光谱仪。前者由激光器、样品室、单色器、检测器和计算机组成;后者由激光器、瑞利散射光过滤器、迈克尔逊干涉仪、样品室、检测器和计算机组成。常用的激光器是铷钇石榴激光器,其波长为1064nm。


3.拉曼光谱的应用。激光拉曼光谱法根据拉曼位移进行物质分子结构的定性分析。在一定条件下,拉曼散射光强度与物质的浓度成正比,可进行定量分析。


拉曼光谱可用于有机物的结构鉴定,如毒品、炸药成分的鉴别;可用于鉴别矿物、玻璃、尘土、土壤,以及文物,如油画、手稿、瓷器、雕塑等的真伪。成像拉曼光谱技术可以显示不同成分圆珠笔交叉笔画的书写顺序。


(五)光谱成像技术


光谱成像(spectralimaging)是运用光谱扫描手段获取的样品光学信息分布图像。可据此图像进行样品的定位、定性和定量分析。


1.光谱成像原理。光谱成像,又称化学成像(Chemical Imaging),是运用光谱扫描手段获取检材试样在不同波长照射下的不同光学行为信息,形成由试样上相应点不同光学参量值构成的信息分布图像。利用光谱成像技术可以采集试样上任意点在一定光谱范围内形成的反映其物理、化学特性的光学信息;试样所有像点的光谱信息可以形成试样特有的物理图像(如微观结构图像)或“化学图像”(如特定组分的分布图像)。光谱成像的目标和特征是将光谱分析技术的定性和定量分析特性与图像分析的定位特性结合起来,构成综合分析系统,从而提供更丰富、全面的分析信息。


根据光谱的范围不同可分为紫外-可见光谱成像、荧光光谱成像、红外光谱成像等。


2.光谱成像技术的应用。由于光谱成像技术特有的兼具成像和光谱探测的优点,已广泛应用于陆地海洋地理遥感,大气、土壤和水体的污染物遥感监测,医疗光谱成像诊断,军事目标侦查探测、监视等多个军事和民用领域。该技术一经引入到法庭科学领域,立即引起极大关注,并已经应用于各种物证的检验。


微量物证包括纤维、油漆、玻璃、粘合剂、墨水等, 是实际案件现场中最易遗留的物质。光谱成像技术的发明, 提供了一个迅速直观的检验方法。在文件检验方面, 可用于区分不同墨水添加的字迹、显现掩盖字迹、消除印章背景等。指纹是最传统的证据之一,光谱成像可以通过特殊光源的选择使常规方法不能显现的指纹,如钞票上的指纹、铝合金上的指纹、油性表面上的指纹等更清晰地显现出来。


 


第三节色谱分析


色谱分析(chromatography)集分离与检测于一体,是重要的近代分析方法之一。该方法具有分离效能高、选择性好、检测灵敏度高、分析速度快等特点,广泛用于各个领域,是多组分混合物分析的最重要方法。在理化物证检验、毒物毒品检验以及书写字迹油墨成分、指纹成分等分析中具有广泛的应用。


一、色谱分析基础


色谱法是一种物理化学分离方法。在色谱体系中有固定相和流动相两个相态。分离过程中,两相作相对运动。预被分离的混合物组分随流动相通过固定相,由于不同物质在两相中具有不同的分配系数,当两相作相对运动时,这些组分得以在两相中进行反复多次的分配,从而使各组分得到完全的分离。


(一)色谱分析方法分类


色谱法有许多类型,常按以下三种方法分类:


1.按两相物态分类。以气体为流动相的,称为气相色谱,该气体称为载气;以液体为流动相的称为液相色谱,以超临界流体为流动相的称为超临界流体色谱。根据固定相是固体吸附剂或分布在惰性载体上的一薄层有机化合物液体(此液体称为固定液),气相色谱又分为气固色谱和气液色谱。同理,液相色谱也分为液固色谱和液液色谱。


2.按组分在两相间的分离机理分类。利用不同组分在吸附剂上的吸附能力不同而实现分离的方法,称为吸附色谱法;利用不同组分在固定液中的溶解度不同而实现分离的方法,称为分配色谱法;利用不同组分在离子交换剂上的亲和力大小不同而实现分离的方法,称为离子交换色谱法;利用组分的分子体积大小不同而在多孔固定相中的选择渗透而实现分离的方法,称为空间排阻色谱法或凝胶渗透色谱法。此外,以毛细管为分离通道,以电场为驱动力,利用不同组分在电介质溶液中电泳淌度的不同而实现分离的方法,称为毛细管电泳法。


3.按固定相所处的“形态”分类。固定相装于柱内的色谱法,称为柱色谱。柱色谱法又分为填充柱色谱法和开管(毛细管)柱色谱法。前者把固定相均匀填充在管内,后者一般把固定相附着在管壁,管中心形成一个细径孔道。固定相呈平面状的色谱法称为平版色谱,它又可分为纸色谱和薄层色谱,前者用滤纸作为固定液的载体,后者将固定相涂布在载版上。


(二)色谱参数色谱参数是色谱仪记录系统记录的色谱流出曲线(色谱图)与色谱分离原理、过程及分析结果有关的参数。色谱分离后的各组分进入检测器后,检测器所给出的信号(浓度或质量)随时间的变化曲线称为色谱流出曲线,亦称色谱图(chromatogram),如图5-17所示。它是组分分离结果的反映,是研究色谱分离机制的基础,是色谱定性、定量分析的依据。                   



 1.相平衡参数。色谱分离过程是组分在固定相和流动相的分配过程,相平衡参数用以描述色谱分离过程中,样品组分在相对运动的两相中的质量或浓度的比例关系。常用的相平衡参数有分配系数与容量因子。

图5-6色谱图


(1)分配系数:温度一定时,达到分配平衡后,样品组分在固定相中的浓度(Cs)与在流动相中的浓度(Cm)之比称为分配系数(K)。





在条件一定(流动相、固定相、温度等)、浓度很稀(Cs、Cm很小)时,分配系数只取决于组分的性质,而与浓度无关。




(2)容量因子:容量因子(k)也称分配容量、容量比及质量分配系数等。





容量因子的物理意义为温度一定时,达到分配平衡后,组分在固定相中的量(Ws)与流动相中的量(Wm)之比。因此容量因子也称为质量分配系数。容量因子与分配系数间的关系为:





它与分配系数的不同点在于,K决定于组分、固定相、流动相的性质及温度,而与体积Vs、Vm无关;而k除了与上述性质有关外,还与Vs、Vm有关。




2.定性参数。定性参数是色谱分析中进行定性分析的依据,主要为保留时间以及由此派生的其他保留值参数。


(1)保留值:①保留时间:保留时间(tR)为从进样开始到某个组分的色谱峰顶的时间间隔,称为该组分的保留时间。表示试样中某组分在色谱柱中停留时间的数值。


②死时间:死时间(tO或tM)指不被固定相滞留的组分从进样开始到其峰顶所对应的时间,亦相当于流动相通过色谱柱所需要的时间。


③调整保留时间:调整保留时间(tR´)指扣除死时间后的保留时间,相当于组分完全在固定相中的停留时间。


             tR´= tR-tO


④相对保留值:相对保留值(α21)指某组分2的调整保留值与另一组分1的调整保留值的比值,是一个无因次量。


α21=tR2´/ tR1´


相对保留值与柱温、固定相性质、流动相性质有关,而与柱长、柱径、流动相速度、柱填充情况等无关。


(2)保留方程:作为色谱定性参数的保留值与物质的容量因子或分配系数间关系的方程称保留方程。


容量因子与保留值的关系为:


tR= t0( 1+ k )


因为 tR´= tR-t0为组分的校正保留时间,即扣除死时间后组分净在固定相中的停留时间,所以:



因此k的数值大小还说明一个组分在色谱柱固定相中溶解(分配)或被吸附等原因所保留的时间(tR´),是不溶解或不被吸附组分的保留时间(t0)的倍数。若倍数大,说明色谱柱对此组分的柱容量大(出柱慢)。因此将k称为容量因子、容量比等。


从上式可推导出保留值与分配系数间的关系式为


tR: 组分在色谱柱中的停留时间,即保留时间;


t0:  死时间,指不与固定相作用的组分在色谱柱中的停留时间;


Vs:  固定相的体积;


Vm:流动相的体积。


在色谱条件确定后,其它参数均为定值,唯有K随组分变化,所以保留值反映了组分的性质。由此式也可说明,分配系数不等是各组分色谱分离的前提。


(3) 保留指数(I):保留指数又叫Kováts指数,是把物质的保留行为用两个紧靠近它的标准物(一般是两个正构烷烃)来标定,并以均一标度来表示。某物质的保留指数可由下式计算。


x为被测物质,z和z+n分别为具有z个和z+n个碳原子数的正构烷烃。n为两个正构碳原子数之差,一般n<4。被测物质的保留值应在这两个正构烷烃的保留值之间。




正构烷烃的保留指数人为地定为它的碳数乘以100,例如正戊烷、正己烷、正庚烷的保留指数分别为500、600、700。因此,欲求某物质的保留指数,只要与相邻的正构烷烃混合在一起(或分别),在给定的条件下进行色谱实验,然后按上式计算其保留值。


性质和柱温有关,用此参数进行分析,其准确度和重现性都很好,误差<1%。


3. 柱效参数。柱效参数是用来评价色谱柱分离效能的一个参数,主要有色谱峰宽度、塔板数和塔板高度。


(1)色谱峰区域宽度:用来衡量色谱峰宽度的参数,在一定分析条件下,色谱峰区域宽度越大(峰越胖)柱效越低;反之则越高。有三种表示方法。


①标准偏差(s)。在数理统计中,讨论正态分布曲线时,将x=±1处(拐点)的峰宽之半称为标准偏差s,相当于峰高0.607倍处色谱峰宽度的一半。标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度,s小,分散程度小、峰形窄,柱效高;反之s大,峰形宽,柱效低。


②半峰宽(W1/2)。色谱峰高一半处的宽度,由s派生出来。


W1/2 =2.354 s


③峰底宽(Wb)。也称为基线宽度。通过色谱峰的拐点作切线,在基线上所截的距离为峰底宽。


Wb=4 s


(2)理论塔板数与塔板高度:理论塔板数(n)和塔板高度(H)是衡量柱效的指标,根据塔板理论推导得出。塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔,塔内有若干块塔板。待分离组分在分馏塔的塔板间移动,在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡,随着流动相的流动,组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板,并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多,则其分离效果就越好。


①   理论塔板数。理论塔板数与色谱参数之间的关系为:


n = (tR /s)2=5.54 (tR /W1/2)2=16(tR /Wb)2


②有效塔板数(n有效)。因为在理论塔板数的计算中使用的保留时间包含死时间,而组分在死时间内不参与分配,如果用调整保留时间(tR´)进行计算,所得数值为有效塔板数。


n有效=(tR´/s)2=5.54 (tR´/ W1/2)2=16(tR´/Wb)2


③塔板高度(H)和有效塔板高度(H有效)。相当于每块塔板的高度。当色谱柱长(L)一定时,塔板数(n)越多,对应的塔板高度(H)越小。


                    H=L/n


                   H有效=L/ n有效


当色谱柱长度一定时,塔板数n 越大(塔板高度H 越小),被测组分在柱内被分配的次数越多,柱效能则越高,所得色谱峰越窄。


因为不同物质在同一色谱柱上的保留时间不同,用塔板数和塔板高度作为衡量柱效能的指标时,应指明测定物质。


 4.定量参数。定量参数是色谱分析中用于对组分含量进行测定的依据。因为检测器的响应信号与待测组分的质量或其在流动相中的浓度成正比,在实验条件恒定时,某组分的峰面积或峰高与其含量成正比,因此,可利用峰面积和峰高进行定量分析。


(1)峰高:色谱峰高为色谱峰顶到基线的距离,当色谱峰为正常峰时,可用峰高定量。


(2)峰面积:指色谱峰与基线围成的面积,是定量分析的主要参数,适合各种色谱峰形的定量。


 5.分离参数。分离参数用来评价色谱分析的分离能力,常用分离度表示,在高分辨体系中,使用分离数等评价指标。


(1)分离度:为判断相邻两组分在色谱中的分离情况,常用分离度(R)作为色谱柱的总分离效能指标。其定义为相邻两个组分色谱峰的保留时间之差与两个组分色谱峰峰底宽度总和之半的比值。


从理论上可以证明,若峰形对称且满足于正态分布,则当R=1时,称为4s分离(两峰顶间距为4s),裸露峰面积≥95.4%;当R=1.5时,称为6s分离(两峰顶间距为6s)分离程度可达99.7%。R=1.5可用作相邻两峰已完全分开的标志。



(2)基本分离方程式:影响分离度的因素很多,通过分离度定义式、保留方程、塔板数计算公式推导出分离度基本分离方程:




式中n为理论塔板数,α称为分配系数比(K2/K1)或容量因子比(k2/k1),k2为相邻两组分中保留时间长的组分的容量因子。


上式说明影响分离度的因素可分为三部分,柱效、柱选择性和柱容量。


(三)色谱分析基本理论


色谱理论主要分为热力学理论及动力学理论两大类。热力学理论是以相平衡为基础研究色谱过程,以塔板理论为代表;动力学理论是以动力学为基础研究色谱过程中各种动力学因素对色谱峰展宽的影响,以范第姆特(Van Deemeter)方程式为代表。


1.塔板理论。塔板理论是色谱法的热力学平衡理论。塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔。精馏塔是分离沸点不同的混合物的一种装置,塔内有数十层塔板,在塔的底层加热,塔的顶部冷凝,利用混合物中各组分沸点不同,在每层塔板上进行气液分配平衡,最终低沸点组分在塔顶馏出,在塔底得到高沸点组分,从而达到分馏的目的。


马丁(Martin)和欣革(Synge)最早提出塔板理论,将色谱柱比作蒸馏塔,把一根连续的色谱柱设想成由许多小段组成。在每一小段内,一部分空间为固定相占据,另一部分空间充满流动相。组分随流动相进入色谱柱后,就在两相间进行分配。并假定在每一小段内组分可以很快地在两相中达到分配平衡,这样一个小段称作一个理论塔板,一个理论塔板的长度称为理论塔板高度H。经过多次分配平衡,分配系数小的组分,先离开蒸馏塔,分配系数大的组分后离开蒸馏塔。由于色谱柱内的塔板数相当多,因此即使组分分配系数只有微小差异,仍然可以获得好的分离效果。


在一定的假设前提下,塔板理论导出了色谱流出曲线方程,成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置;并且得出了直观、简单的评价色谱柱柱效的塔板数(n)计算公式。


虽然塔板理论在解释流出曲线形状、浓度极大点位置以及评价柱效等方面是成功的,但它的某些假设与实际色谱过程不符,如组分在塔板内达到分配平衡以及纵向扩散可以忽略等。塔板理论所假设的分配平衡,只是色谱过程的理想状态、极限状态,而真实的色谱过程是一个动态过程,由于流动相处于流动状态,组分在两相间很难达到分配平衡。其次,在色谱过程中,被分离的样品组分以“塞子”的形式在色谱柱中移动,“塞子”前后存在浓度梯度,纵向扩散不能忽略。因此塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、峰高,客观地评价色谱柱的柱效,却不能很好地解释与动力学过程相关的一些现象,如色谱峰峰型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。


2.速率理论。速率理论是把色谱过程作为一个动态过程,研究色谱过程中动力学因素对峰展宽(柱效)的影响,1956年VanDeemeter全面概括了影响气相色谱柱效的动力学因素,提出了气相色谱速率理论方程。


(1)速率理论方程(Van Deemeter方程):速率理论描述了色谱过程中影响塔板高度(H)的因素。


                 H = A + B/u + C·u


式中H为理论塔板高度(cm),u为载气的线速度(cm/s),A、B、C为三个常数,单位分别为cm、cm2/s、s。


速率理论方程式说明,在u一定时,A、B、C三个常数越小,H越小,峰越锐,柱效越高。反之则峰展宽,柱效低。


①涡流扩散项(A项):A项称为涡流扩散项,也称多径扩散项。是由于色谱柱填充不均匀,导致同一组分中的不同分子经过多个不同长度的途径流出色谱柱造成的峰展宽。


图5-8多经扩散示意图


A = 2λdp


其中dp为固定相的平均颗粒直径,λ为固定相的填充不均匀因子。dp越小越好,但太小,不易填充,且柱阻越大。填充越不均匀,λ越大。开管(空心)毛细管柱,只有一个流路,无多径项,A=0。


②   纵向扩散项(B/u项):B/u为分子扩散项,也称分子扩散项、浓差扩散项。在色谱过程中,组分“塞子”的前后,因存在浓度差而产生纵向扩散,引起色谱峰展宽。


图5-9 纵向扩散项示意图


B = 2 νDm


式中,ν为弯曲因子,Dm为试样组分分子在流动相中的扩散系数(cm2·s-1)。ν为与填充物有关的因数,填充柱色谱,ν<1。毛细管柱因无扩散的障碍,ν=1。


扩散即浓度趋向均一的现象。扩散速度的快慢用扩散系数衡量。纵向扩散程度与分子在流动相中的停留时间及扩散系数成正比。组分在流动相中的扩散系数与流动相的分子量、粘度成反比。气相色谱中,流动相为气体,组分在气体中的扩散系数大,分子量越小的载气,组分在其中的扩散越大。而且气相色谱中柱温很高,导致扩散严重。液相色谱中,流动相为液体,粘度比载气大的多,而且柱温多采用室温,因此液相色谱中的Dm比气相色谱的Dm约小105倍。液相色谱中的纵向扩散一项可以忽略不计,速率理论方程可以简化为


H = A + C·u


纵向扩散项(B/u)与流动相的流速有关。流速越大,组分在色谱柱中的停留时间越短,产生的扩散越小,反之越大。


③传质阻抗项(Cu项)。Cu为传质阻抗项,C为固定相传质阻抗系数(Cs)及流动相传质阻抗系数(Cm)之和。


                  C=Cs+Cm


其中        Cm=Cm’(dp2/Dm)


 Cm’为比例系数,dp为固定相的粒径,Dm为组分在流动相中的扩散系数。


             Cs=2k/3(1+k)2· df2/Ds


k为容量因子,df为液膜厚度,Ds为组分在固定液中的扩散系数。


传质过程即组分在固定相和流动相之间的分配平衡过程。以气相色谱为例,样品混合物被载气带入色谱柱后,组分在气、液两相间进行分配,由于组分与固定相分子间的作用力,使组分由气-液界面溶入固定液,进而扩散到固定液内部,而后趋向“分配平衡”。由于载气的流动,使这种“平衡”被破坏。当纯净的载气或含有低“平衡”浓度的载气到来时,固定液中该组分的分子将逐次回到气-液界面,逸出,而被载气带走(转移),这种溶解、扩散、平衡及转移的整个过程称为传质过程,影响此过程进行的阻力称为传质阻抗,用传质阻抗系数描述。


固定相传质阻抗Cs是说明影响在固定液中传质速度的因素。由于传质阻抗的存在增加了组分在固定液中的停留时间,而使组分晚回到气相中,因此落后于原在气相中随同载气流动的该组分,使色谱峰展宽。图5-21说明了传质阻抗对峰展宽的影响。


降低固定相的粒度,减少固定液液膜厚度,提高温度,可降低传质阻抗对峰展宽的影响。此外该项与流速有关,u越小,越可以满足分配平衡所需要的时间,所以该项导致的峰展宽越小。


(2) 板高(H)与流速(u)的关系:根据速率理论方程,用H对u作图,可得H-u二次曲线图(图5-22)。由于流速对纵向扩散项和传质阻抗项具有完全相反的作用,因此使得流速对柱效的总影响存在着一个最佳流速值,即曲线最低点所对应的H最小(H最小或Hmin),可通过速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数为零求得,此时柱效最高,对应的流速称为最佳流速(u最佳或uOpt)。


(3) 速率理论的实践指导意义:速率理论阐明了组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰展宽、柱效下降的主要原因,阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指导。通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度、流动相流速及色谱柱内经与长度可提高柱效。


色谱分析中,各种因素相互制约,如载气流速增大,分子扩散项的影响减小,使柱效提高,但同时传质阻力项的影响增大,又使柱效下降;柱温升高,有利于传质,但又加剧了分子扩散的影响,选择最佳条件,才能使柱效达到最高。


(四) 色谱定性定量方法


1.定性方法。色谱法中应用最普遍的定性方法是利用保留值定性。这种方法只需在色谱柱和操作条件(流动相及其流速、色谱柱温等)不变时,与标准品的保留值进行比较,确定未知物是否与标准品为同一物质。采用这一方法定性时,为了避免不同组分在同一色谱柱上具有近似或相同的保留值而得出错误的结论,常常需要采用双柱或多柱进行保留值比较定性,若未知物与标准品为同一物质,则在任何色谱柱上,相同色谱条件下的保留值应始终一致,否则将可能出现差异。这一方法增加了定性的可靠性。在选择不同色谱柱时,应使色谱柱的极性有较大的差别。由于不同物质在相同的色谱条件下可能具有近似或完全相同的保留值,因此这种方法的应用有很大的局限性,只适用于已知范围内未知物的定性,即未知物通过其它途径已被确定为某几个化合物或属于某种类型时作最后的确证,不足于鉴定完全未知的物质。


2.定量方法。色谱定量分析的依据是被测组分的重量或其在载气中的浓度与检测器的响应信号成正比。在实验条件恒定时,峰面积与组分的含量成正比,因此,可利用峰面积定量,正常峰也可用峰高定量。


(1)定量校正因子:由于同一检测器对不同的物质具有不同的响应值,所以两个相等量的物质得出的峰面积往往不相等,因此不能用峰面积直接计算物质的含量。为了使检测器产生的响应信号能真实反映物质的含量,就要对响应值进行校正,因此引入定量校正因子。


组分的定量校正因子可通过测定该组分标准品在已知进样量下的峰面积计算求得。若组分量用重量表示,得重量校正因子;若组分量用摩尔表示,则得摩尔校正因子。实际定量分析中,常采用相对法,即通过标准品标定进行定量,标准品的作用实质是求得定量校正因子。


(2)定量方法:色谱定量方法常采用外标法、内标法等,对全部出峰且性质相近的组分也可以通过归一化法确定某一组分的含量。


二、气相色谱法


气相色谱分析(gas chromatography,GC)是以气体作为流动相的色谱分析方法。用作流动相的气体称为载气。


(一)气相色谱仪


1. 气相色谱分析的一般流程。气相色谱仪是实现气相色谱分离分析过程的装置。它的原理流程图如图5-23所示。载气由高压钢瓶供给,经减压阀减压后,进入载气净化干燥管以除去载气中的水分和其它有机杂质。由针形阀控制载气的流量,流量计和压力表用以指示载气的柱前流量和压力。


试样注入汽化室,使液态样品转变为气态,由载气携带进入色谱柱,各组分彼此分离后依次进入检测器。检测器信号由记录仪记录,就可得到色谱图。


2.气相色谱法的特点与应用。气相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、样品用量少、分析速度快及应用广等优点。因为样品混合物需要在气体状态下分离和检测,因此受样品蒸汽压限制。对于极性较强、挥发性、热稳定性较差的液体,一般需制备衍生物间接采用气相色谱法分析;对于固体样品,可采用裂解方法。据统计,能用气相色谱法直接分析的有机物约占全部有机物的20%。


气相色谱法目前已广泛应用于石油化学、化工、有机合成、医药、生物化学、食品分析、毒物毒品分析、环境监测等众多领域。


(二)气相色谱柱


色谱柱由固定相和柱管组成,是色谱分析的重要部分。气相色谱按柱径不同,可分为填充柱色谱和毛细柱色谱,前者是将固定相填充在内径常为2mm~6mm左右的金属或玻璃柱中,后者是将固定相涂布或键合在内径为0.1mm~0.5mm的玻璃或石英毛细柱内壁上,中心是空的,故也称开管柱。


按分离机制不同气相色谱又可分为分配柱和吸附柱。它们的区别在于使用不同的固定相。吸附柱是采用吸附剂做固定相,利用组分在吸附剂上的吸附系数的差别实现分离;分配色谱是采用高沸点液体做固定相,称为固定液。将其涂渍在载体(惰性多孔物质)表面上,利用组分的分配系数差别实现分离。将固定液通过化学反应键合在载体表面,称为化学键和相,具有不流失的特点。


1. 固体吸附剂。常用气-固色谱中的固定相有吸附剂、分子筛、高分子多空微球及化学键合相等。吸附剂常用石墨化碳黑、硅胶及氧化铝等。分子筛是一种特殊吸附剂,具有吸附和分子筛两种作用。若不考虑吸附作用,分子筛是一种“反筛子”,分离机制与凝胶色谱类似。高分子多孔微球(GDX)是一种人工合成的新型固定相,也可以用作载体。它由苯乙烯(STY)或乙基乙烯苯(EST)与二乙烯苯(DVB)交联共聚而成,聚合物为非极性。若STY与含有极性基团的化合物聚合,则形成极性聚合物。高分子多孔微球的分离机理一般认为具有吸附、分配及分子筛三种作用。


吸附剂与分子筛多用于永久性气体及低分子量化合物的分离分析,而高分子多孔微球的用途更广。


 2.固定液。固定液一般为高沸点的液体,在操作温度下为液态,在室温时为固态或液态。固定液的种类有数百种,按照化学结构分类如下:


(1)烃类:包括烷烃与芳烃。常用的有角鲨烷,是标准的非极性固定液。


(2)硅氧烷类:是目前应用最广的通用性固定液。其优点是温度粘度系数小、蒸汽压低,流失少,对大多数有机化合物都有很好的溶解能力。包括从弱极性到极性多种固定液。这类固定液的基本化学结构为:




①如果结构式中R为甲基,为甲基硅氧烷,如SE-30(350℃)、OV-1(350℃)等,是一类耐高温、弱极性固定液;


②如果R为苯基,称为苯基硅氧烷。根据苯基与甲基的比例不同分为低苯基硅氧烷,如SE-52(5%,300℃);中苯基硅氧烷,如OV-17(50%,(350℃);高苯基硅氧烷,如OV-25(75%,300℃)。因为苯基的极性高于甲基,因此这类固定液的极性比甲基硅氧烷高,且随苯基含量增高,极性增强。


③R为三氟丙基(-CH2CH2CF3),为氟烷基硅氧烷,是一类中等极性固定液。


④R为氰乙基(-CH2CH2CN)为氰基硅氧烷,是一类强极性固定液,氰乙基含量越高,极性越高。


(3)醇类:是一类氢键型固定液,可分为聚合醇与非聚合醇两类。聚乙二醇如PEG-20M(平均分子量20000,250℃)是常用的固定液之一。


(4)酯类:是中强极性固定液,分为非聚合酯与聚酯两类。聚酯类多是二元酸与二元醇生成的线性聚合物,如丁二酸二乙二醇聚酯),在酸性或碱性条件下或200℃以上的水蒸气能使聚酯水解。


(5)其他固定液:常用的还有腈类固定液,这类固定液极性很强,对非极性化合物保留值很小,而对极性化合物以及易被极化的化合物则有很高的保留值和选择性;还有用于分离芳香异构体的有机皂土固定液,以及硝基苯类、胺类、酰胺类、杂环类固定液等。用于特殊分离的液晶固定液、手性固定液等。


(三)气相色谱检测器


检测器是将流出色谱柱的载气中被分离组分的浓度(或量)的变化,转化为电信号(电压或电流)变化的装置。色谱柱与检测器构成分离-分析一体化的现代仪器分析方法。


1.检测器的分类。(1) 浓度型与质量型检测器:根据检测特性可将检测器分为浓度型检测器和质量型检测器。浓度性检测器的输出信号强度(R)与载气中的浓度(C)成正比,与载气流速(u)无关。当组分浓度一定时,峰高(h)基本与载气流速无关,但峰面积则与流速成反比。如热导池检测器为浓度型检测器。质量型检测器的输出信号强度(R)与单位时间进入检测器的组分量(dW/dt)成正比。它的输出信号强度R与进入检测器的样品速度成正比。当进入检测器的组分浓度一定时,所得峰高与载气流速(u)成正比,而峰面积与流速无关。常用的氢火焰检测器属于质量型检测器。


(2)通用型和选择型:根据应用的范围分为通用型(广普型)检测器和选择型检测器。通用型检测器对所有组分都有相应信号,如热导池检测器;选择型检测器只对特殊组分有相应信号或响应灵敏度高,如电子捕获检测器对电负性组分的响应灵敏。


根据检测时是否破坏样品分为非破坏性检测器和破坏性检测器。


2.氢火焰离子化检测器。氢火焰离子化检测器(flame ion detector, FID)利用有机物在氢气燃烧形成的火焰作用下化学电离而形成离子流,通过测定离子流的强度对组分进行检测。该检测器具有灵敏度高、响应快、线性范围宽等优点,是目前最常用的检测器之一。但这种检测器只能测定有机化合物,检测时样品被破坏。


有机物在氢火焰中发生化学电离,产生的正离子和电子在外加恒定直流电场的作用下分别向两极定向运动而产生微电流(约10-6 A~10-14A);在一定范围内,微电流的大小与进入离子室的被测组分质量成正比,所以氢焰检测器是质量型检测器。组分在氢焰中的电离效率很低,大约五十万分之一的碳原子被电离。离子电流信号输出到记录仪,得到峰面积与组分质量成正比的色谱流出曲线


2.电子捕获检测器。电子捕获检测器(electron capture detector, ECD)是一种对电负性组分有选择响应的检测器。它是一种放射性离子化检测器,其能源为一种放射源,如3H或63Ni。载气进入放射源时,发生电离,产生电子与带正电荷的离子,在电场作用下形成响应基流。当电负性组分随载气进入检测器后,会捕获电子,使基流降低,基流降低的程度与载气中电负性组分的浓度成正比。


该检测器选择性好,灵敏度高,可达10-14g/ml,是生物化学、医学、药学、毒物学中一种强有力的检测手段。但这种检测器线性范围窄,易受污染,且放射源对人体有害,应正确使用。


3.氮磷检测器。氮磷检测器(NPD)也叫碱盐离子化检测器,其结构与FID相似,只是在FID的喷嘴和收集极之间加了一个珠状的碱盐源,常用的是非挥发性的硅酸铷玻璃珠(Rb2SiO3)。含氮、磷原子的有机物在火焰上燃烧过程中,同碱金属离子相互作用。其燃烧产物或是促进碱盐的蒸发,增大火焰中碱盐的蒸气压;或是同时提高了碱盐的电离度,从而增大了碱金属离子化的过程,而使信号电流大大增加。这种检测器对含氮、磷等杂原子的有机化合物具有高选择性和灵敏度,最小检测量可达10-12 g~10-13g,因此在农药、药物分析等方面得到较为广泛的应用。


(四)气相色谱分析条件选择


在气相色谱分离中,色谱柱、柱温及载气流速的选择是影响分离的重要实验条件,选择的好坏影响分离度的结果。


1.色谱柱的选择。选择色谱柱主要是选择固定相。固定相选择需注意极性和最高使用温度两个方面。气相色谱中常用的弱极性固定相有SE-30、OV-1;中等极性固定相有OV-17;高极性固定相有聚乙二醇(PEG)等。固定相极性按相似相溶原则选择,即被分离组分与固定相的极性相似,官能团相似、结构相似,则被分离组分与固定相的作用力大,保留时间长,分离效果好。在分析高沸点化合时,需选择高温固定相。


2.柱温的选择。柱温对分离影响很大。选择时需综合混合物的沸点、固定相的最高使用温度、固定液配比等因素。柱温不能超过固定相的最高使用温度。一般是在最难分离的组分有尽可能好的分离度的前提下,尽可能采取较低柱温,但以色谱峰保留时间适宜及不托尾为度。低柱温可增大分配系数,减少固定液流失,延长柱寿命及降低检测器本底。


对于宽沸程样品,即混合物中高沸点组分与低沸点组分的沸点之差很宽的混合物,需采取程序升温法。即按照一定的程序改变色谱柱的温度,使各组分都在较佳的温度下分离。程序升温可以是线性的,也可以是非线性的,可按需要选择。程序升温不仅可以改善复杂成分的分离效果,还具有缩短分析时间、改善峰形、提高检测灵敏度等特点。


3.气化室和检测器温度的选择。气化室温度取决于样品的挥发性、沸点及进样量。可等于样品的沸点或稍高于沸点,以保证迅速完全气化。但一般不要超过沸点50℃以上,以防样品分解。对于灵敏度差的样品可用高灵敏度检测器,降低进样量,这时样品可在远低于沸点温度下气化。


为了使色谱柱的流出物不在检测器中冷凝而污染检测器,检测室温度需高于柱温。一般可高于柱温30℃~50℃左右,或等于气化室温度。


4.毛细管气相色谱分流比的选择。分流进样是毛细管气相色谱中最常用的进样方式。分流比为放空样品量与进入毛细管柱中样品量之比。柱前分流装置有两个作用。一是因为毛细管的柱容量很小,要求进样量很小,为此需要采用分流技术。即样品在汽化室瞬间汽化,当打开分流阀时,大部分载气和试样被放空,仅有少量进入色谱柱,从而实现小的进样量;另一个作用是为了保证汽化室的载气流量很大,减少汽化室死体积对峰展宽的影响。


分流比的大小应根据柱内径和样品浓度进行调节,通常为30:1至500:1。分流进样会产生分流失真,使得定量准确性和重复性变差。


对于极性大、沸点高的痕量组分的分析可采用不分流进样,且定量分析的误差小。


(五)气相色谱分析其他技术


1.顶空气相色谱。顶空气相色谱法是对液体和固体中易挥发性组分进行气相色谱分析的一种分析技术,可用于易挥发组分的测定,如矿物油、血液中的乙醇。该方法不需对待测物进行前处理,操作简单、不污染色谱柱、不破坏样品,但定量的重复性较差。


2.裂解气相色谱。裂解气相色谱法是将样品置于一严密控制的环境中加热,使之裂解为挥发性的小分子碎片,然后用气相色谱法分离和检测这些碎片,得到裂解产物色谱图;通过裂解色谱图进行分析。该技术可直接取样分析,简单快速,广泛用于高分子化合物,如橡胶、塑料、纤维、涂料、粘合剂、纸张、润滑油等的品种鉴定和比对分析。使样品裂解的装置称作裂解器。常用的裂解器有热丝裂解器、居里点裂解器、激光裂解器、管式炉裂解器等。


3.衍生化气相色谱法。气相色谱法的应用受待测组分沸点、极性和热稳定性的限制,对沸点高、极性大、热稳定性差的样品不适用直接气相色谱分析。通常采用化学反应的方法将其转化为沸点低、极性小、热稳定性好的衍生物,再进行气相色谱分析。这种方法称为衍生化气相色谱法,与样品进行衍生化反应的试剂称为衍生化试剂。


可根据待测组分的官能团的不同选择不同的衍生化反应,常用的气相色谱衍生化反应有硅烷化、酰化、烷基化等反应。醇、酚、羧酸和胺类化合物均能进行硅烷化反应;羧酸类化合物可采用烷基化反应;氨基酸、生物碱、糖类等含羟基、氨基的化合物可进行酰基化反应。衍生化反应后的产物挥发性提高、极性降低、热稳定性增加,且可改善分离性能及提高检测灵敏度。


三、液相色谱法


以液体作为流动相的色谱法称液相色谱法,仪器化的液相色谱法称高效液相色谱法(highperformance liquid chromatography,HPLC)。因流动相采用高压输送、色谱柱采用高效固定相等,使该方法具有分离效能高、分析速度快等特点。与气相色谱法比较,液相色谱法不受样品挥发性、热稳定性、极性、大分子量等限制,样品只要能制成溶液,就可通过不同类型的液相色谱法实现分离。分子量较大、沸点较高以及无机盐类等样品,都可用高效液相色谱法进行分析,因此,它是气相色谱法的补充和发展。


(一)高效液相色谱法的分类


液相色谱按分离机制可分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、凝胶渗透色谱等。


1.液-固吸附色谱。流动相为液体,固定相为固体吸附剂的色谱法称为液-固吸附色谱法。该法依据混合物中各组分吸附能力的差别实现分离。在吸附色谱法中,硅胶是最常用的吸附剂,常用的流动相是以烷烃为底剂加入适量的极性调整剂组成的二元或多元溶剂系统。溶剂系统的极性越大,洗脱力越大,容量因子k越小,tR越小。控制流动相的极性,可以控制组分的保留时间。


吸附色谱适宜分析极性差别小的结构异构体。结构与吸附剂活性中心排列一致的异构体保留作用强。


2.液-液分配色谱。固定相为液体的色谱法称为分配色谱。该法依据混合物中各组分在两相中的溶解度差别(即分配系数K的差别)实现分离。按照固定相与流动相的极性差别,可把液-液色谱法分为正相与反相液-液色谱。


(1)正相色谱:流动相极性小于固定相极性的液-液色谱称为正相液-液色谱(normal phase chromatography),简称正相色谱法。氰基与氨基化学键合相是正相色谱常用的固定相,流动相的选择与以硅胶为固定相的吸附色谱法一致。由于固定相为极性,流动相为非极性或弱极性,因此分离时,样品中极性小的组分在固定相中的溶解度小,先流出色谱柱,保留时间短,而极性大的组分在固定相中的溶解度大,后流出色谱柱,保留时间长。


正相色谱用于分离有机物中极性及中等极性的分子型组分。主要靠组分的极性差别分离,因而主要用于含不同官能团物质的分离。


(2)反相色谱:流动相极性大于固定相极性的液-液色谱称为反相液-液色谱(revered phase chromatography),简称反相色谱。典型的反相色谱法是用非极性固定相,常用十八烷基硅烷(ODS或C18表示)键合相;流动相常用甲醇-水或乙腈-水。与正相色谱相反,极性大的组分在固定相中溶解度小,先流出色谱柱,极性小的组分在固定相中的溶解度大,保留时间长,后出峰。流动相的极性增大,洗脱能力降低,k增大,tR增大;反之,k与tR减小。调整溶剂的极性,可控制组分的保留时间。


反相色谱法是应用最广的液相色谱法,主要用于分离非极性至中等极性的各类分子型化合物,因为键合表面的官能团不流失,流动相的极性可以在很大的范围内调整,加之由它派生的反相离子对色谱与离子抑制色谱法,可以分离酸、碱、盐等离子型化合物,因此应用范围很宽。


(3)离子对色谱:反相离子对色谱法(paired ion chromatography)可用于分析酸、碱、盐等离子型化合物。它是把离子对试剂加入极性流动相中。被分析的离子在流动相中与离子对试剂(反离子)生成不带电荷的中性离子对,从而增加了在非极性固定相中的溶解度,使分配系数增加,分离效果改善。可用于生物碱、有机酸等的分离。


(4)离子抑制色谱:离子抑制色谱法(ion suppression chromatography)主要用于分离弱酸、弱碱,通过调整流动相的pH值,抑制它们的解离,增加中性分子的比例,从而增加其在固定相中的溶解度。通常分析有机弱酸时向流动相中加入少量弱酸(常用醋酸)、分析有机弱碱时向流动相中加入少量弱碱(常用氨水)为抑制剂。在采用离子抑制色谱法时,流动相的pH值需在2~8之间,超出此范围可能使键合相的基团脱落,或腐蚀仪器流路系统。


3.离子交换色谱。离子交换色谱 (ion exchange chromatograph)中固定相为离子交换树脂,依据混合物中各组分离子与交换树脂上基体离子的亲合力的差别实现分离。分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。流动相为缓冲溶液,调整缓冲溶液的pH值、盐的强度等可调整组分的离子型比例及与树脂结合的几率,从而调整组分的保留值。


离子交换色谱法可用于分析酸、碱、盐等离子型化合物,可实现无机阳离子、阴离子等混合物的分离,在无机炸药成分的检验中应用较多。


4.空间排阻色谱。固定相为多孔凝胶的色谱称凝胶渗透色谱,又叫空间排阻色谱(steric exclusion chromatography),依据混合物中各组分的分子大小不同实现分离。固定相为具有一定孔径范围的多孔性凝胶,流动相为样品的良溶剂。


凝胶渗透色谱主要用于合成高分子混合物及生物高分子混合物的分离及分子量的测定。


(二)高效液相色谱仪


高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器及放大记录系统组成。各部分的作用与气相色谱法相同,但仪器构件与气相色谱仪不同。输液泵、进样器、检测器及微机(工作站)是液相色谱仪的基础部件。


1.输液泵。高效液相色谱分析中是利用输液泵来实施流动相的输送。对输液泵的要求是无脉动、流量恒定并且可以自由调节。一般要求流量变化在2%~3%以内。还要求耐高压、耐腐蚀、适于进行梯度洗脱等。


输液泵的种类很多,按输出液体的情况,可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒压泵流量受柱阻的影响,流量不恒定,目前多用恒流泵。恒流泵按结构不同,可分为螺旋泵和往复泵。螺旋泵缸体太大已被淘汰。往复泵又分为柱塞往复泵及隔膜往复泵。多用柱塞往复泵。


2.进样装置。进样器在色谱柱的进口处,目前的高效液相色谱仪都采用六通进样阀。


六通进样阀如图5-27 所示,在状态a位置,用微量注射器将样品注入储样管。进样后,转动六通阀手柄至状态b,储样管内的样品被流动相带入色谱柱。储样管的体积固定,可按需更换。用六通阀进样,具有进样量准确、重复性好、可带压进样等优点。


3.色谱柱。由柱管和固定相组成,柱管多用不锈钢制成,管内壁要求具有很高的光滑度。固定相粒度很小(2μm~10μm)。一般分析型色谱柱规格为常量柱,内经(I.D.)2 mm~4.6mm,柱长250px~625px;半微量柱,内经1 mm~1.5mm,柱长250px~500px。液相色谱柱发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。


4.检测器。液相色谱仪检测器是将流出色谱柱的组分浓度变化信号转变为电信号的部件。要求检测具有器灵敏度高、噪声低、线性范围宽、重复性好、适用化合物种类广等性能。目前应用较多的是紫外检测器(UVD)、荧光检测器(FD)和电化学检测器(ECD)。示差折光检测器(RID)虽然是通用性检测器,但因受温度影响大,灵敏度不高,已少用。


(1)紫外检测器:检测器由光源、流通池(池体积一般为8μL)、检测元件、微机(工作站)及记录器组成。是利用样品组分通过检测器流通池时对特定波长的紫外吸收而引起透光强度的变化。浓度与吸光度的关系服从Lamber-Beer定律。


紫外检测器灵敏度高,噪音低,不破坏样品,可用于梯度淋洗等优点。但只能检测有紫外吸收的样品。


紫外检测器分为固定波长型、可变波长型和二极管阵列检测器。


(2)荧光检测器:检测原理及光学结构与荧光法相同,只是流通池替代了样品池。荧光检测器的灵敏度高于紫外检测器,检测限可达10-10g/ml。但只适用于能产生荧光的物质,可通过衍生化引入荧光基团用该检测器检测。


(三)高效液相色谱固定相


高效液相色谱中的固定相直接关系到柱效和分离度。在高效液相色谱中对固定相的要求比气相色谱分析要求高的多。


1.液-固色谱固定相。液固色谱固定相多是具有吸附活性的吸附剂。常用的有硅胶、氧化铝及高分子多孔微球,其他还有分子筛和聚酰胺等。


2.化学键合相。用化学方法将固定液的官能团键合在载体表面上所形成的固定相称为化学键合相(chemically bonded phase),简称键和相。键合相的优点是:使用过程官能团不流失;化学稳定性高,在pH2~8的溶液中不变质;热稳定性好,一般在70℃以下稳定;载样量大;适于作梯度淋洗。


按官能团与载体(硅胶)相结合的化学键类型,分为Si-O-C与Si-O-Si-C(硅氧烷)型。Si-O-C型键合相因易发生水解而损坏,已被淘汰。目前多用硅氧烷型键合相,按极性可分为非极性、中等极性与极性三类。键合相的性质与键合官能团性质与链长、载体性质与表面覆盖度等有关。


 (1)非极性键合相:这类键合相表面基团为非极性烃基,如十八烷基、辛烷基、甲基与苯基(可诱导极化)等。十八烷基(octadecylsilyl,ODS或C18)键合相是最常用的非极性键合相。将十八烷基氯硅烷试剂与硅胶表面硅醇基经多步反应生成ODS键合相。键合基团的链长增加,极性下降,载样量增大,k值增大,例如C18大于C8。这类固定相用于反相色谱。


(2)中等极性键合相:常见的有醚基键合相(如YWG-ROR')。这种键合相即可作正相色谱固定相,也可作反相色谱固定相,视流动相的极性而定。


(3)极性键和相:常用氨基、氰基键合相,分别将氨丙硅烷基[—Si(CH2)3NH2]及氰乙硅烷基[Si(CH2)2CN]键合在硅胶上制成,可用作正相色谱固定相。


3.其他固定相。(1)离子交换剂:离子交换剂是用于离子交换色谱的固定相,分为离子交换树脂和键合型离子交换剂两类。离子交换树脂是以高分子聚合物,如苯乙烯-二乙烯苯为基体,经化学反应在其骨架上引入离子交换基团而成;键合型离子交换剂是以全多孔球形或无定型硅胶为基体,其表面经化学反应键合上离子交换基团。强酸性磺酸型(-SO3H)阳离子交换剂和强碱性季铵盐(-NR3Cl)阴离子键合相,分别是阳离子和阴离子交换色谱法常用的固定相。根据所引入基团能电离出阴、阳离子的程度,又可分为强碱、弱碱或强酸、弱酸性离子交换剂。如含羧基或酚羟基的弱酸性阳离子交换剂。


(2)凝胶:凝胶是空间排斥色谱法所用的固定相,是具有一定孔径范围的多孔性物质。根据耐压程度,分为软质、半硬质、硬质凝胶。软质凝胶(如葡聚糖等)在压强0.1MPa左右即被压坏,因此只能用于常压下的凝胶色谱法;半硬质凝胶是由苯乙烯和二乙烯苯交联的聚合物,具有可压缩性,能装填紧密,柱效高,可用作以有机溶剂为流动相的高效凝胶渗透色谱法的固定相;硬质凝胶可分为多孔硅胶及多孔玻璃珠等种类,属于无机凝胶。其优点是在溶剂中不变形,孔径尺寸固定。缺点是装柱时易碎,不易装紧,柱效较差。


(四)高效液相色谱流动相


在气相色谱中,可供选择的载气只有三、四种,而且它们的性质差异不大,因而主要是通过选择固定相和改变柱温来改善分离效果。在液相色谱中,可供选择做流动相的溶剂有几十种,而且还可以组成多元溶剂系统与不同配比,选择余地很大。在固定相一定时,流动相的种类、配比能严重影响分离效果。因此在HPLC中,流动相的选择至关重要。


1.流动相对分离的影响。因为分配系数(K)和容量因子(k)分别为分配达到平衡时,组分在固定相和流动相中的浓度比和质量比,当固定相一定时,某一组分的K或k就主要与流动相有关,因此液相色谱中,流动相的选择对分离的影响极大。


2.正相色谱流动相。在正相色谱中,由于固定相的极性大于流动相的极性,所以增加流动相的极性(P’值增大),洗脱能力增强,同时样品的k值降低。一般选择具有合适P’值的流动相,使样品的k值为1~10.


一般在饱和烷烃中(如正己烷)中加入一种极性较大的溶剂(如异丙醇)作为极性调节剂构成的混合溶剂作为正相色谱常用的流动相。调节极性溶剂的浓度可以改变流动相的洗脱强度。确定溶剂的极性参数P’值后,若分离选择性不好,可以改用其他类型的溶剂。对于难以达到所需分离选择性的情况,可以考虑使用三元或四元溶剂体系。


3.反相色谱流动相。在反相色谱中,溶质按其疏水性大小进行分离,极性越大或疏水性越大的溶质,与非极性固定相的结合越弱,越先被洗脱。


反相色谱流动相通常以水作为基础溶剂,加入一定量能与水互溶的极性调节剂(如甲醇、乙腈、四氢呋喃等)配成混合流动相。极性溶剂所占比例对溶质的保留值和分离有显著影响。一般情况下,甲醇-水系统能满足多数样品的分离要求,是反相色谱最常用的流动相。


反相液相色谱中的流动相强度由有机溶剂的浓度和类型共同决定,常用溶剂洗脱强弱顺序为:水(最弱)<甲醇<乙腈<四氢呋喃<丙醇<二氯甲烷(最强)。


溶剂的强度随其极性的增加而降低。除二氯甲烷与水无法互溶外,其他溶剂都可以与水互溶。二氯甲烷常用来清洗被强保留样品污染的反相色谱柱。


4.离子交换色谱流动相。离子交换色谱常用缓冲溶液作为流动相。被分离组分在交换柱中的保留与流动相的pH、离子强度等有关。pH可改变化合物的解离程度;流动相的离子强度越高,对组分离子的保留越小。


5.空间排斥色谱流动相。空间排斥色谱是依据样品相对分子质量大小实现分离,分离效果与样品、流动相之间的相互作用无关,流动相只需是样品的良溶剂而与分配系数无关。


凝胶渗透色谱主要用于高聚物的相对分子量测定,常用四氢呋喃。其对样品一般有良好的溶解性和适宜的粘度,且可使小孔径的聚苯乙烯凝胶溶胀,因此被广泛使用。


凝胶过滤色谱主要用于生物大分子的分离,通常使用不同pH的缓冲溶液作为流动相。


(五)超高效液相色谱


超高效液相色谱(ultraperformance liquid chromatography,UPLC)是美国 Waters 公司于2004年的匹兹堡会议上推出的分离科学中的一个全新类别。其采用1.7μm 细粒径的新型固定相,可获得高达 2万块/m理论塔板数的超高柱效,并以系统整体设计的创新技术,全面提升了液相色谱的速度、灵敏度和分离度,造就了液相色谱性能上的飞跃和进步,并形成分离科学的一个新兴领域。


 1.理论基础。根据液相色谱速率理论方程H = A + C·u,其中A ∝dp ,  C ∝dp2 ,uopt∝1/dp,因此H∝dp。即随色谱柱中装填固相粒度dp的减小,色谱柱的理论塔板高度 ( H)也愈小,色谱柱的柱效愈高,并可获得更宽的线速度范围,达到分离分析的高速、高效和高灵敏度。图5-29为不同固定相粒度下的H-u曲线,可直观反映粒度对板高(柱效)以及最佳流速(uopt)范围的影响。


UPLC借助于HPLC(高效液相色法)的理论及原理,涵盖了小颗粒填料、非常低的系统体积及超高压输液泵和快速检测手段等全新技术,增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。


2.超高效液相色谱的特点。色谱柱中装填固定相的粒度是对UPLC分析能力影响的最重要的因素。根据速率理论以及分离度方程,粒度降低,可使柱效提高、分离度提高、灵敏度提高、分析速度提高。采用新型全多孔球形、耐高压的1.7μm反相固定相,其提供的柱效较5μm颗粒提高了3倍,分离度提高了70%;在满足相同分离度的情况下,柱长可缩短至常规5μm颗粒色谱柱长的三分之一。因此可加快分离过程,获得更窄的色谱峰和峰容量,因此,UPLC比HP LC具有更高的分离度、分析速度和灵敏度。


四、高效毛细管电泳


利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。毛细管电泳(CapillaryElectrophoresis,CE)是以极细的毛细管为分离通道, 以高压电场为驱动力, 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术


(一)毛细管电泳分离基本原理


1.双电层与Zeta 电势。双电层是指两相之间的分离表面由相对固定和游离的两部分离子组成的与表面异号的离子层,凡是浸没在液体中的界面都会产生双电层。在毛细管电泳中,无论是带电粒子的表面还是毛细管管壁的表面都有双电层。


电介质溶液中,任何带电粒子都可被看成是一个双电层系统的一部分,离子自身的电荷被异号的带电离子中和,这些异号离子中有一些被不可逆的吸附到离子上,而另一些则游离在附近,并扩散到电介质中进行离子交换。“固定”离子有一个切平面,它和离得最近的离子之间的电势则被称之为离子的Zeta 电势。


石英材质的毛细管是毛细管电泳中最常使用的毛细管,管子内表面在pH>3 情况下带负电,当其与溶液接触时,会形成紧贴内表面的和游离的两部分离子。这两部分离子组成的与表面电荷异号的离子层,即为双电层,其中第一部分又称之为Stern 层。第二层为扩散层。扩散层中游离部分离子的电荷密度随着和表面距离的增大而急剧减小。在Stern 层和双电层的游离部分的起点的边界层之间的电势称之为管壁的Zeta 电势。典型值大体在0mV -100 mV 之间,Zeta电势的值随距离增大按指数衰减,使其衰减一个指数单位所需的距离称之为双电层的厚度(δ)。熔硅表面的Zeta 电势与它表面上的电荷数及双电层厚度有关,而这些又受到离子的性质、缓冲溶液pH 值、缓冲溶液中阳离子和熔硅表面间的平衡等因素的影响。


2.淌度、绝对淌度和有效淌度。带电粒子在直流电场作用下于一定介质(溶剂)中所发生的定向运动称为电泳。单位电场下的电泳速度称为淌度(mobility)。在无限稀释溶液中(稀溶液数据外推)测得的淌度称为绝对淌度(absolute mobility, μab)。电场中带电离子运动除了受到电场力的作用外,还会受到溶剂阻力的作用。一定时间后,两种力的作用就会达到平衡,此时离子作匀速运动,电泳进入稳态。此时对于球形离子,迁移速度


实际溶液的活度不同,特别是酸碱度不同,所以样品分子的离解度不同,电荷也将发生变化,这时的淌度可称为有效电泳淌度(effective mobility, μef)。一般来说,离子所带电荷越多、离解度越大、体积越小,电泳速度就越快。


3.电渗、电渗流和表观淌度。电渗是推动样品迁移的另一种重要动力。所谓电渗是指毛细管中的溶剂因轴向直流电场作用而发生的定向流动。电渗是由定域电荷引起。定域电荷是指牢固结合在管壁上、在电场作用下不能迁移的离子或带电基团。在定域电荷对溶液中的反号离子吸引下形成了所谓的双电层,致使溶剂在电场作用(以及碰撞作用)下整体定向移动而形成电渗流 (electroosmotic flow, EOF) 。毛细管中的电渗流为平头塞状。


电渗流大小受到Zeta电势、双电层厚度和介质粘度的影响,一般说来,Zeta 电势越大,双电层越薄,粘度越小,电渗流值越大。中性物质可以用作测定电渗流大小的标记物。例如二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、β-萘酚、丙酮、甲醇和乙醇等,均可作为电渗标记物用来测定电渗流。


ν电渗流 = Lef/teo


式中,Lef 为毛细管有效长度; teo为电渗流标记物(中性物质)的迁移时间。


在毛细管电泳中,样品分子的迁移是有效电泳淌度和电渗流淌度的综合表现,这时的淌度称为表观淌度(apparentmobility, μap)。表观淌度可由下式计算:





式中:Lef为从进样口到检测器的有效毛细管柱长;Lt为总毛细柱长;V 为电压;t为迁移时间。




在多数的水溶液中,石英(或玻璃)毛细管表面因硅羟基解离会产生负的定域电荷,产生指向负极的电渗流。在毛细管中电渗速度可比电泳速度大一个数量级,所以能实现样品组分同向泳动。正离子的运动方向和电渗一致,因此它应最先流出。中性分子与电渗流同速,随电渗而行。负离子因其运动方向和电渗相反,在中性粒子之后流出。电渗流与pH 的关系十分密切。电渗受Zeta 电势的影响,Zeta电势由毛细管壁表面的电荷决定,而电荷又受到缓冲溶液的pH值影响,所以电渗流的值是缓冲溶液的pH值的函数,一般随pH 值的增大而增大,到中性或碱性时,其值会变得很大。此外,任何影响管壁上解离的因素,如毛细管洗涤过程、电泳缓冲液组成、浓度、粘度、温度等都会影响或改变电渗流。电磁场以及许多能与毛细管表面作用的物质如表面活性剂、蛋白质等,都可以对电渗流产生很大影响。


4.柱效与理论塔板数。根据速率理论,柱效用Van Deemter方程式,H=A+B/u+Cu讨论。在高效毛细管区带电泳中,使用空心毛细管柱,无涡流扩散项(A=0)。内壁也不涂渍固定液,消除了流动相平衡所需要的时间,使传质阻抗项(Cu)趋于零。因此,Van Deemter表达式为:


            H = B/u=2Dt


式中H为板高,B/u为纵向扩散项,D为组分的扩散系数,t为组分的迁移时间。


因此理论塔板数为


          n=L/H=μapV/2D


因为电泳分离中,A=0,C/u=0,因而大大提高了柱效。而在HPLC中H=A+Cu。因此,HPCE比HPLC的柱效高的多,每米毛细管柱的理论塔板数可达105(片)以上。此外,在毛细管电泳中,电荷均匀分布且整体移动,电渗流的流动为平流、塞式流动(谱带展宽很小);而液相色谱中的溶液流动为层流,抛物线流型,管壁处流速为零,管中心处的速度为平均速度的2倍(引起谱带展宽较大)。


(二)毛细管电泳仪


 HPCE仪主要由高压电源、毛细管、背景电解质贮液槽、检测器及工作站等部分组成。基本结构如图5-32所示。一根长约1250px~2500px,内径25μm~100μm的熔融毛细管柱,一端由进样装置吸入样品,一端经过检测器。毛细管两端插入电解质贮液槽中,用高压电源外加约20kV~30kV的稳定电压。





图5-15 毛细管电泳仪器简图

    1. 高压电源。由毛细管柱的理论塔片数计算公式可知,柱效与高压电源的电压成正比。为了获得较高的柱效,毛细管电泳仪的电源电压一般高达20 kV~30kV。高压源是毛细管电泳仪的重要部件。要求有良好的电压稳定性和较高的输出电压。但过高的电压会在毛细管内部产生焦耳热,因此电压应适宜,还要使用冷却方式稳定毛细管的温度。




2.进样方式。毛细管进样方式有电动进样和气动进样两种。


电动进样也称为电迁移进样,是利用电泳机制使样品在外加的进样电压作用下沿毛细管内壁进入毛细管。在这种进样方式下,毛细管的阳极先不与缓冲液接触,而直接注入样品溶液中,然后在很短的时间内施加进样电压,使样品通过电迁移进入毛细管。电迁移进样装置简单,适用于粘度较大的样品,但定量重复性差,且可能发生因各组分扩散系数差别而形成迁移速度不同,产生样品失真。


气动进样也称为压差进样,是最常用的进样方法。具体有三种,一是在进样端加压,二是在出口端减压,三是调节进样端和出口端之间的相对高度使之产生虹吸作用而将样品引入。在保证样品粘度和温度恒定时,气动进样可保证进样量恒定,且没有组分歧视效应。


3.检测器。紫外检测器是目前毛细管电泳仪中用得最多的一种检测器。目前应用最广泛的是二极管阵列(PDA)检测器。检测点在毛细管的末端,使用时需要把一小段管子(小于25px)的聚酰亚胺外涂层去掉,使观测池暴露出来。这种在柱上完成的紫外检测受到了毛细管柱内径的限制,特别是由于毛细管的曲度,实际光程还要小于柱的内径。为了提高灵敏度,可采用聚光增强入射光强度、提高光程长度等设计方法。


用于毛细管电泳的检测器还有灵敏度很高的激光光热(LIP)和荧光(FL)检测器。近些年,在实际应用中还产生了激光诱导荧光(LIF)、有良好选择性的安培(EC)、通用性很好的电导(CD)以及可以获得结构信息的质谱(MS)等多种检测器。迄今为止,除了电感耦合等离子体(ICP)和红外(IR)技术没有和CE联用,其他的检测方法均和CE联用并且大部分实现商品化。


(三)毛细管电泳分离模式


 1.毛细管区带电泳。溶质混合物在毛细管的缓冲溶液中以不同速度迁移而形成的一个一个独立的溶质带的电泳模式称为毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis, CZE)。其分离的基础是淌度的差别,用于带电物质的分离。


所用的石英毛细管柱, 在 pH > 3 的情况下, 其内表面带负电,和溶液接触时形成了一双电层。在高压电场作用下, 双电层中的水合阳离子引起流体整体地向负极方向移动,这种现像叫电渗。粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流两种速度的矢量和。正离子电泳方向和电渗流一致, 故最先流出;中性粒子的电泳流速度为零, 故其迁移速度与电渗流速度相同;负离子的电泳方向和电渗流方向相反, 但因电渗流速度一般都大于电泳流速度, 因此它将在中性粒子之后流出, 从而各种粒子因迁移速度不同而实现分离。


毛细管区带电泳具有分离方便、快速、样品用量小的特点,在炸药残留物、金属离子、毒物毒品、氨基酸的分离中有着广泛的应用。


2.胶束电动色谱。在毛细管区带电泳中,因中性物质的淌度差为零,所以不能分离中性物质。胶束电动色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography,MECC,或 MEKC)是在缓冲液中加入表面活性剂,当表面活性剂的浓度超过临界浓度后, 就会形成表面荷电、内核疏水的胶束,可看作为一“准固定相”。在电场力的作用下,水相溶液由EOF驱动流向阴极(内壁未处理的石英毛细管),离子胶束在柱中移动,并依其电荷极性不同,移向阳极或阴极。这时体系中有两个相:一相是带电的离子胶束,它具有与周围介质不同的电泳淌度;另一相是导电的水溶液相;溶质基于在水相和胶束间的分配系数不同实现分离。因此可根据中性粒子的疏水性不同将其分离。该模式可用于中性物质的分离, 拓宽了的CE的应用范围。


最常使用的表面活性剂是十二烷基磺酸钠(SOD),当其在缓冲溶液中的浓度达到临界浓度时,形成一疏水内核、外部带负电的胶束,其泳动方向与EOF相反,朝阳极泳动。多数情况下,EOF速度大于胶束电泳速度,所以胶束的实际移动方向与EOF相同。中性溶质基于色谱分离原理,在以电渗流驱动的水溶液流动相和受到电泳阻滞、运动较慢的胶束之间进行分配。疏水性较强的溶质与胶束的作用力强,相对于疏水性较弱的溶质迁移速度慢。未结合的溶质随EOF流出。因此中性溶质按其疏水性的不同,在两相间的分配系数不同而得到分离。


各种阴阳离子表面活性剂和环糊精等添加剂使得本法有相当多的选择余地,可广泛应用于各种类型的样品。加入手性表面活性剂,可用于对映体的分离。


3.毛细管凝胶电泳。毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis ,CGE)是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方式。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶,其具有多孔性,类似分子筛的作用,混合组分按分子的大小分离。


毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点。电泳峰尖锐,柱效极高,可在短柱上实现极好的分离。因为蛋白质、DNA等组分的电荷/质量比与分子大小无关,CZE模式很难分离,采用CGE能获得良好分离,是DAN排序的重要手段。目前已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核酸、DNA等强有力的工具。如应用CGE分离与激光诱导荧光检测相结合,用于DNA序列快速分析。


4.毛细管等电聚焦电泳。毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing,CIEF)是根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术;首先毛细管内充有两性电解质(合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物),将阴极放到碱溶液中,阳极放到酸溶液中,当施加直流电压(6 V~8V)时,管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度。氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关,在酸性溶液中带正电荷,反之带负电荷。在其等电点时,呈电中性,淌度为零。带电的两性离子和蛋白质在介质中开始迁移直到它们到达一个不带电的区域(pI处),这个过程称为“聚焦”。所以可根据等电点差别分离生物分子。


5.毛细管等速电泳。毛细管等速电泳(capillary isotachophoresis ,CITP)是一种“移动界面”电泳技术,在CITP中,使用两种缓冲体系造成所有被分离的区带等速迁移的状态。被分离区带像夹心面包一样,被夹在前导电解质和尾随电解质之间。如对负离子分析时,前导电解质的淌度大于试样中所有负离子。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进,逐渐形成各自独立的区带从而实现分离。阴极进样,阳极检测。其分离特点是界面明显,具有富集、浓缩作用,当毛细管中充有连续电解质时,就构成了CZE电泳。


6.毛细管电色谱。毛细管电色谱(capillary electrochromatography, CEC)是一种将CZE的高效分离效能与高效液相色谱技术结合在一起的分析技术。该技术将高效液相色谱众多的固定相微粒填充到毛细管中,用电场力(不是液压)作动力推动流动相通过填充的毛细管柱,以样品与固定相间的相互作用为分离机制。用小内径的填充柱得到最高效的分离效果。


中性和带电荷样品分子根据其在色谱固定相和流动相间吸附、分配系数的不同和电泳速率的不同而分离。由于CEC综合了电渗流塞子流型与液相色谱固定相、流动相选择性多的特点,因而在分离选择性、柱效等方面显示了很大的优势。


7.毛细管电泳在线畗集技术。毛细管电泳在线(或在柱)样品富集的方法是通过对样品、背景缓冲溶液的组成以及进样程序进行简单的调控实现的,无需对商品仪器进行改造。利用这些方法可以提高检测灵敏度,降低样品的浓度检测限,拓展CE在包括痕量分析的众多领域的应用。目前已经提出了许多在线富集的方法,而且这些富集方法并没有明显地丧失分离效率。在这些方法中除了通过提高样品进样量或增加进样时间(如电迁移进样)外,一些电泳参数,如缓冲液的电导率、pH值、电渗流(EOF)的大小和方向、表面活性剂(如果使用的话)的浓度、样品溶液的长度、甚至电场的极性都需要进行优化。


样品堆积(sample stacking)技术是毛细管电泳在线富集技术中最简单的模式,这种富集效应是基于因电场强度不同所引起的待测物电泳速度的骤变实现的。具体地说,样品堆积是将样品溶解于低导溶液中,并使样品溶液在高电导背景溶液中运行。当低导和高导溶液同时存在于毛细管中并施以电压时,则低导区的电场较高导区的强,样品离子在低导区的迁移速度比在高导区快。当样品离子穿越低导区域和背景缓冲溶液的边界时,样品离子的迁移速度骤降从而导致了样品的堆积,使样品区带长度缩短,样品浓度相应地提高,从而达到富集的目的,如场放大样品堆积(field-amplified sample stacking, FASS),大体积样品堆积(large-volume sample stacking, LVSS),pH 调制堆积和在胶束电动色谱中的堆积模式。


扫集技术(sweeping)是胶束电动色谱中常用的富集模式。在这一方法中,背景缓冲液(BGS)中含有表面活性剂(如带负电的SDS)形成胶束缓冲液,而样品则溶解在不含胶束的缓冲液中。为了抑制EOF,应使这些溶液的pH保持在较低的数值,因为这一方法不是基于EOF进行分离。一旦BGS和样品溶液进入毛细管后,整个分离是在反向电压下完成的。阳离子向入口端迁移,阴离子则向相反的方向迁移。结果是带负电荷的SDS进入毛细管并且扫过组分。组分被扫入SDS后依据MEKC模式分离。富集的效果取决于样品在准固定相(胶束)中分配能力的大小或者是样品与准固定相的相互作用的大小。样品与胶束的亲和力越强, 富集效果越好。这是一种简单方便的在线带电组分和中性组分的富集方法。在此基础上提出的阳离子-,或阴离子-选择性耗尽进样-扫集-胶束电动色谱(CSEI-,ASEI-sweeping-MEKC)的在线富集技术,显著地提高了电泳方法的灵敏度。


此外,由于速度差异引发的聚焦方法(velocitydifference-induced focusing, V-DIF),如动态pH联接(DynamicpH Junction)和动态pH联接-扫集(Danamic pH Juction – sweeping);瞬时等速电泳与电动超电荷(Transient ITP and Electrokinetic Supercharging,Tr-ITP and EKS)等富集技术也建立起来。所有这些技术克服了毛细管本身光程很短的不足,为微量成分的分析开辟了一个全新的领域。


第四节质谱与色谱-质谱联用


质谱(massspectrometry, MS)是对物质进行成分和结构分析的方法。将质谱仪器作为色谱检测器的方法为色谱-质谱联用方法,该方法解决了单一色谱仪器定性能力差的不足。


一、质谱与质谱仪


将化合物以某种方式电离形成离子和碎片离子,离子混合物经过质量分析器按照质荷比进行分离,记录其相对强度并排列成谱,得到的谱图为质谱图。实现这一过程的仪器为质谱仪,它通常由五部分组成。


(一)离子源


离子源是电离试样而产生离子的场所,并把具有一定能量的离子会聚成某种几何形状的离子束。目前应用的有电子轰击源(EI)、化学电离源(CI)、场电离源(FI/FD)、快原子轰击源(FAB)、以及用于液相色谱-质谱联用的几种离子源,有热喷源(TS)、粒子束源(PB)、电喷源(ESI)。用于GC/MS的离子源主要是EI,并辅以CI。


1.电子轰击电离。电子轰击电离(electron ionization,EI)是质谱中应用最广泛、发展最成熟的离子化方式。用金属钨或铼制成的灯丝在高真空中被电流加热,发射出电子并与有机化合物的蒸气分子相互作用,使其失去电子形成正电荷离子,这一过程称为电子电离。有机化合物的离子化电位(IP)一般在7eV~13eV,轰击电子的能量只要高于IP值,就能使有机化合物电离,不过离子化效率却很低。由电子能量和离子化效率的关系可得出50eV时离子化效率最大。通常使用70eV,因为前者能量上的微小变化会导致离子化效率的明显变化。高于100eV会增加分子离子的裂解几率,降低分子离子峰的强度。


电子轰击法为常规分析的手段,对70~80%的有机化合物是有效的。但对一些热稳定性差、难汽化、极性大的样品,得不到分子离子峰。这是由于样品的热分解或者分子离子裂解特性所决定,只能得到一些碎片峰,甚至得不到谱图。


2.化学电离。化学电离(chemical ionization,CI)是利用蒸气分子与反应气体的离子相互反应而使样品分子离子化。由于分子-离子反应的过程并不给予分子离子过多的剩余能量,因而减少了分子离子进一步发生裂解的几率,增加了分子离子峰强度,减少了碎片离子峰,故化学电离属于一种软电离技术。它具有与EI可比的灵敏度和强的分子离子峰或准分子离子峰。


3.电喷雾电离。电喷雾离子源(electrospray ionization, ESI)是一种广泛应用于与液相色谱联用的质谱离子源。液相色谱流出液晶金属毛细管,在毛细管和对电极板之间世界3 kV -8kV 电压,使流出液(试样溶液)形成高度分散的带电扇状喷雾。所形成的离子,在电场力的作用下通过一氮气帘,气帘的作用是使雾滴进一步分散,以利于溶剂蒸发,并阻止中性的溶剂分子,而让离子穿过进入质量仪。


电喷雾电离是最软的电离技术,通常只产生分子离子峰,因此可直接测定混合物,并可测定热不稳定的极性化合物;其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA 等生物大分子,最大相对分子质量可测到200 000。


4.大气压化学电离。大气压化学电离(atemspheric pressure chemical ionization, APCI)接口也称为热气动喷雾接口。液相色谱流出液经中心毛细管被雾化和辅助气喷射进入加热的常压环境中(100~120C),通过加热喷射形成雾滴,虽可有离子直接蒸发进入气相,但由于没有ESI的条件,直接蒸发成气态的分析物离子数量不足以产生质谱信号,因此在APCI中,分析物的电离主要通过化学电离的途径。如图所示,在喷嘴附近,放置一针状电晕放电电极,通过其高压放电,使空气中某些中性分子电离,产生丰富的H3O+,O2-和O-等。当喷射出的气溶胶混合物接近放电电极时,大量的溶剂分子也会被电离,上述大量的例子与分析物分子进行气态例子-分子反应,从而实现化学电离,形成质子转移、加成物等准分子离子。APCI主要产生的是单电荷离子,一般用于分子质量小于1000的化合物的分析。


(二)质量分析器


分子离子(或准分子离子)由于带有一定的剩余内能而会发生进一步裂解,因此在离子源中存在着不同的质荷比的离子。通过质量分析系统将它们一一分离,并按质荷比的大小进行强度检测。质量分析器分为两类:静态质谱仪使用的电场、磁场、离子运动轨迹等参数在不同的时间里都是稳定的,随时间而改变其中一些参数是为了记录谱图,并非是质量分离的要求;动态质谱仪使用周期变化的电场。磁质谱仪和四极杆质谱仪是最常用的仪器。


1.静态单聚焦质量分析器。它是由一个扇形磁场组成。由于它只能起到方向聚焦的作用,故称为单聚焦,图5-40为它的离子光学系统示意图。可把磁场看作“光学透镜”,从离子源出来的离子束有发射角,经磁场偏转后又聚在收集器。这是由于不同质量的离子,有不同的偏转半径,磁场就起到在空间把不同质荷比离子加以分离的作用。在实际工作中,只需扫描磁场即可把不同质荷比的离子依次进入收集器。


2.四极杆质量方析器。四极杆质量方析器由四根平行、对称的圆柱面(或双曲面)电极构成(图5-41)。由于它对不同质荷比离子有过滤作用,也称为四极滤质器。它的工作原理为在互为正交的二对电极上加以相为相反的直流电压和辐射高频电压,使二对电极所包围的空间内产生双曲面电场。带电粒子在该电场中运动有两种情况:某种质荷比离子以有限大小的振幅稳定地通过四极滤质器抵达收集器;其它离子的运动振幅随时间延长而增大,最后碰到电极上而不能通过滤质器。仪器在实际工作时,通过改变高频电压使不同质荷比离子依次通过四极滤质器,获得质谱图。四极杆质谱仪不需狭缝,并依靠电压扫描,因而具有高的灵敏度和快速扫描的优点。目前绝大多数GC/MS装置使用四极杆质谱仪质量分析系统。


3.离子阱质量分析器。离子阱质量分析器又称为三维四极质谱质量过滤器。由一个双曲线表面的中心换电极和上下联个端电极形成一个室腔(阱)。直流电压和高频电压加在环形电极和端盖电极之间,两端电极都处于地电位。IT的聚焦作用与四极杆类似,在适当的条件下,特定的离子在阱内稳定区,其轨道振幅保持一定大小,并可长时间在阱内停留。反之不稳定的离子(为满足特定条件者)振幅很快增长,撞击电极而消失。向IT内通氦气,可使离子向中心迁移,更紧密的聚焦,提高其质量分辨能力。检测时在引出电极上加负电压脉冲使正离子离开离子阱到达检测器。


离子阱质量分析器的离子损失小,离子利用率高,灵敏度高。而且只需改变离子阱射频场的控制参数,很易作到MS/MS…MS10串联质谱分析(多级质谱)。


4.飞行时间质量分析器。飞行时间质量分析器(TOF)是一个离子漂移管。由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管,并以恒定速度飞向离子接收器。离子质量越大,到达接收器所用时间越长,离子质量越小,到达接收器所用时间越短,根据这一原理,可以把不同质量的离子按m/z值大小进行分离。


飞行时间质谱仪可检测的分子量范围大,扫描速度快,仪器结构简单。这种飞行时间质谱仪的主要缺点是分辨率低,因为离子在离开离子源时初始能量不同,使得具有相同质荷比的离子达到检测器的时间有一定分布,造成分辨能力下降。改进的方法之一是在线性检测器前面加上一组静电场反射镜,将自由飞行中的离子反推回去,初始能量大的离子由于初始速度快,进入静电场反射镜的距离长,返回时的路程也就长,初始能量小的离子返回时的路程短,这样就会在返回路程的一定位置聚焦,从而改善了仪器的分辨能力。这种带有静电场反射镜的飞行时间质谱仪被称为反射式飞行时间质谱仪


(三)离子检出系统


电测法的离子检出系统包括离子收集器、信号放大器、谱图显示及记录装置。用在GC/MS仪上的离子收集其主要是电子倍增管和闪烁检出/光电倍增器。二者均具有高的灵敏度。前者以一定能量的离子打在阴极上产生二次电子,几经倍增,增益可达106倍以上;后者是利用产生的二次电子引起闪烁器发光,然后由光电倍增器接收,增益可达106。与电测法不同的是离子干板测定,它将电测法的收集、放大、记录三个功能合并为一。但由于干板冲洗麻烦和灵敏度的限制,目前已开始使用二极管阵列装置作为离子收集器。


(四)真空系统


质谱仪是在高真空条件下进行工作的。离子产生后经质量分离到收集器的整个过程中不希望它与其它残存气体分子发生碰撞而损失一部分能量而造成运动轨迹的偏离、灵敏度减弱和分辨率降低。通常电子轰击源的真空度约为1.33x10-4Pa,真空系统可以用扩散泵和机械泵来实现,目前有的采用无油高真空系统,即分子涡流泵。


二、气相色谱-质谱联用


气相色谱-质谱联用 (GC/MS)就是将气相色谱仪与质谱仪联接构成的仪器。联用仪的关键部位是接口,接口的作用是将气相色谱流出物中的载气除去,只将组分引入到质谱仪中。


(一)联用分析提供的信息


 1.总离子流色谱图。总离子流色谱图(total ion chromatogram,TIC)的横坐标可为时间,也可为扫描数;纵坐标为离子流强度。若是截取离子源中部分离子流所得到的总离子流色谱图,它所给出的信息与色谱图相似,如保留时间、峰高、峰面积等。


2.选择离子监测图。选择离子监测(selected ion monitor, SIM)是在联机检测时,对预先选定的某个或某几个特征质量峰进行单离子或多离子检测,而获得的某种或几种质荷比的离子流强度随时间的变化曲线,是一种色谱记录方式。又称为质量碎片图,其中的色谱峰不仅表征含量,而且表征能够产生这种质量碎片的组分的性质,能够对某些未分开的色谱峰进行分辨。其检测的灵敏度比总离子流检测高二至三个数量极。


3.质谱图。质谱图为带正电荷的离子碎片(包括母体离子)质荷比与其相对强度之间关系的棒图谱。质谱图的纵坐标为具有某种质荷比的离子的相对丰度,横坐标为质荷比,对于单电荷离子(z=1)也就是该离子的质量值。它给出关于相对分子质量和结构的特征信息。质谱图中最强峰为基峰,其强度规定为100%。其它峰则以此峰为准确定其相对强度。图5-43为甲基苯丙胺的EI和CI质谱图。


质谱图的解析,一般除运用检验外,还要参考各类化合物的质谱规律、标准质谱图(电子轰击源,70eV)以及有关的质谱数据等。


(二)标准谱图与检索


大部分的GC/MS分析获得低分辨的质谱图,因此确定未知色谱峰归属的有效捷径是进行谱库检索。谱库检索的成功取决于三个因素:一是谱库的容量,目前有NIST和Wiley两种谱库,前者有62000个化合物的电子轰击电离谱,后者有11844个化合物的14000张谱图;二是一张可靠的质谱图是检索的基础,由此才能获得高的匹配率;三是结果的可靠有赖于标准样品或标准柱的保留时间。


有时即使获得高的匹配率,还不能确定化合物的正确结构,这是因为有各种异构体,它们的质谱图很相似,仅在于某些峰的强度上有些差异,而这种差异容易被掩盖。因此检索的结果提供了匹配率极为接近的几个结果,单纯依靠匹配率的微小差异很难判断它的正确结构。确认某一色谱峰的归属,还应当用标准品在相同实验条件下比较它们的谱图和保留时间。在不能获取标准样品时也可以借用文献的相对保留时间值作为参数,进行判断。


三、液质联用仪


液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题:不挥发性化合物分析测定;极性化合物的分析测定;热不稳定化合物的分析测定;大分子量化合物(包括蛋白、多肽、多聚物等)的分析测定;一般没有商品化的谱库可对比查询,只能自己建库或自己解析谱图。所以目前液质联用在环境领域主要应用于有标准物质参照情况下的定性分析。


液质联用仪,主要应用于药物代谢及药物动力学研究、临床药理学研究、天然药物(中草药等)开发研究、新生儿筛选、蛋白与肽类的鉴定、残留分析、毒物分析、环境分析-公安、环保、食品、自来水、卫生防疫等行业。


液相色谱与质谱联用常采用串联质谱法,即选择第一级质谱得到的碎片离子进行断裂,形成二级碎片离子。根据两个质谱的离子关系,可分为母离子模式、子离子模式、多反应控制模式、中性碎片丢失模式。可以用来研究母离子和子离子的关系,获得裂解过程及离子组成的信息。还可以从干扰严重的质谱中抽取有用数据,大大提高质谱检测的选择性和灵敏度,从而能够测定混合物中的痕量物质。


四、电感耦合等离子体质谱


电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)是以电感耦和等离子体作为离子源,用质谱仪进行检测的无机多元素分析技术。电感耦合等离子体(ICP)与原子发射光谱仪所用的ICP相同,该技术将ICP的高温(7000K)电离特性与质谱仪的灵敏快速扫描的优点相结合而形成一种新型的元素和同位素分析技术,可分析几乎地球上所有元素。


在ICP-MS中,样品在高温离子源(ICP)中进行蒸发、解离、原子化、电离等过程。离子通过样品锥接口和离子传输系统进入高真空的MS部分,MS部分通过高速顺序扫描分离测定所有离子,扫描元素质量数范围从6到260,浓度线性动态范围达9个数量级从ppq到1000ppm。因此,与传统无机分析技术相比,ICP-MS技术提供了最低的检出限、最宽的动态线性范围、干扰最少、分析精密度高、分析速度快、可进行多元素同时测定以及可提供精确的同位素信息等分析特性。ICP-MS的谱线简单,检测模式灵活多样:可通过谱线的质荷比进行定性分析;通过谱线全扫描测定所有元素的大致浓度范围,即半定量分析,不需要标准溶液,多数元素测定误差小于20%;用标准溶液校正而进行定量分析,是日常分析工作中应用最为广泛的功能;同位素比测定是ICP-MS的一个重要功能,可用于地质学、生物学及中医药学研究上的来源追踪的研究及同位素示踪,禁毒实践中可用于毒品原植物以及毒品生产渠道追踪。 


五、直接电离质谱技术


直接电离质谱是近期发展起来一离子化技术,实现了从传统封闭式电离到敞开式电离、从块状固体样品到各种固体、再扩大到包括膏体、胶体、液体、气体等各种形态的样品,从二维平面电离到三维空间电离,从非生命静物分析到生命过程的活体分析的转变,标志着常压快速质谱分析技术研究新时代的来临。


(一)直接电离质谱技术原理


传统的质谱分析技术采用封闭式的电离技术,分析样品需要封闭在一定的管道或者在一定的真空环境中;且分析样品均需经过至少两步的样品预处理阶段,将不同物质形态的样品转化成为分析样品。导致分析效率较低,难以满足现代分析化学对原位、实时、在线、非破坏、高通量、低耗损等质谱学方法的迫切需要。


由能量守恒和电荷不灭定律可知,能量交换和电荷传递完全可以在常压条件下进行。由此研究出复杂基体样品直接离子化的工作模式。不同类型的能量源(如光子、电场等)通过关键两个步骤: ( 1)作用于特定载体(如试剂、微小液滴等)上,形成具有一定能量的带电体(如初级试剂离子、带电液滴等);(2)采用一定手段将此电荷和能量的载体与二维表面或三维空间中的原生态样品直接作用, 在相对开放的空间内把能量和电荷传递给待测物分子,完成待测物的离子化,形成待测物离子后进入质谱仪中进行后续分析。


(二)直接电离质谱技术应用


直接质谱分析在食品安全、药品质量、环境安全、原位活体分析、代谢组学分析、蛋白组学分析等方面都得到了应用,显示出快速、灵敏、简便、准确的特点。如在不需要样品预处理的情况下,可测定辣椒面、番茄酱、火腿肠、鸡蛋饼中微量的苏丹红类染料;可对纸张、棉布表面的痕量氨基酸、多肽、茶叶进行了快速测定;表面解吸常压化学电离(DAPCI)、低温等离子体探针(LTP)、常压辉光放电解吸电离(APGDDI)等通过电晕放电产生初级离子, 不使用有毒有害试剂, 对样品没有化学污染, 可用于食品的远程、在线检测;与中性解吸(ND)联用的电喷雾萃取电离(EESI)(ND-EESI)技术将采样和电离过程分开, 通过中性气流对蔬菜、水果表面进行解吸采样, 然后将采集的样品引入到EESI进行电离, 可以进行在线分析和远程分析, 对样品无化学污染和破坏作用。


应用电喷雾解吸电离(DESI)技术可在常压下对固体表面上痕量待测物直接离子化,测定多种表面上吸附的TNT、RDX等爆炸物。采用介质阻挡放电电离(DBDI)技术对RDX、TNT等爆炸物直接进行解吸电离,从而可以在无需样品预处理的情况下对复杂基体样品进行快速质谱分析;采用ND-EESI技术可远程检测人体皮肤上的TNT, RDX, NG, HMX和TATP等爆炸物。与DESI等技术相比, ND-EESI更加灵敏, 而且具有较强的远程在线分析的能力, 这对于安全检测、反恐防爆等具有积极的意义。用于现场直接分析的新型纳升电喷雾萃取电离( nanoEESI)技术,无需任何样品预处理, 可对杂环类农药百草枯和拟除虫菊酯类农药氯氰菊酯进行现场快速检测。


(三)质谱成像


直接电离质谱技术使得质谱成像(mass spectrometry imaging,MSI) 成为一种新型的成像技术。该技术已在生命分析中得到应用,它通过对生物组织表面直接进行质谱扫描和分析,将扫描产生的离子信号通过数据处理与图像重建技术结合,能够确定病变组织和正常组织中不同部位的特定分子位置及相对含量,能够跟踪药物及其代谢产物的空间分布等,在了解组织病理特征、疾病诊断、药物疗效及发现生物标志物和疾病愈后评估等临床应用中扮演着越来越重要的角色


利用该技术将溶剂喷到指纹的表面然后对指纹上散落下的小液滴进行分析,可获得比其它技术分辨率更好的“化学肖像”。该技术无需进行样品处理,可以现场检测到手指表面的痕量化合物(如分泌物中的代谢物或者可卡因、大麻等外源性化合物),并且可根据指纹的质谱影像进行指纹个体识别。


 


本章小结


现代仪器分析是利用光学、电磁学、热力学、动力学、物理化学等原理,利用计算机、数学、物理学、化学、材料学和工艺学的最新知识建立的分析方法,具有灵敏度高、准确度高、自动化程度高、应用范围广等特点。


光谱法是一类利用利用构成物质的分子和原子的能级结构特征,通过与电磁辐射的相互作用而对物质和元素进行分析的方法。光谱分析的基本原理是分子和原子的能级跃迁。与电磁辐射作用的介质是分子还是原子决定了是分子光谱还是原子光谱;能级跃迁的方向决定了是发射光谱还是吸收光谱;分子光谱中能及跃迁的类型决定了是电子光谱(紫外-可见光谱),还是振动光谱(红外光谱)等。光谱的产生与分子和原子的结构有关,因此是定性的重要工具,同时光谱的强弱与待测物的浓度有关,因此可进行定量。光谱方法一般适用于纯品的结构和成分确定或进行比对分析。


色谱法是一类分离分析方法,其主要功能是对混合成分进行分离,然后进行定性和定量分析,根据流动相不同可分为气相色谱法和液相色谱法,两者适用的分析对象不同。前者对待测物的要求是易挥发、热稳定性好,但不适用于大分子、难挥发、易分解、不稳定的化合物,而液相色谱可进行这类化合物的分析。毛细管电泳是液相色谱的补充和发展,具有分离效率高、经济、环保、快速、应用范围广的特点,可以分析离子化合物、生物大分子化合物、两性化合物等,DNA测序极为毛细管电泳分析原理。


质谱分析也是对化合物进行结构确定和定性的方法,特征性强,目前主要作为色谱分析的检测手段,适用于分离后纯化合物的检测,也可用作混合物中特征离子的检测。


思考题


1.什么是光谱法?如何分类?


2.为什么紫外-可见光谱主要用作定量方法而不是定性方法?


3.红外光谱适用于哪些类物质的检测?它的主要特点是什么?


4.色谱法的分离原理是什么?分离的依据是什么?


5.一个组分的色谱峰可用那些参数描述?这些参数有什么意义,受哪些因素影响?


6.比较气相色谱法和液相色谱法的原理、仪器和应用的异同。


7.柱效评价的指标是什么?如何计算?


8.根据速率理论说明如何选择色谱分析条件?柱温、流速、粒度如何影响柱效?


9.解释毛细管区带电泳中各种物质的出峰顺序。


10.什么是色谱-质谱联用?什么是选择离子监测模式,有哪些应用?