第四章  检材处理技术

教学重点与难点:微量物证与毒物毒品分析中常用的检材处理技术原理、设备、特点、操作及适用范围。

 

刑事或民事案件中涉及的检材形态有气体、液体和固体。完整的分析过程包括检材采集、检材处理、仪器分析(或化学分析)、数据处理与结果表达。原始检材的物化性质、采集方法、制备方法以及对检材的分析程序,决定了能够获得的信息量和分析结果的质量,除了某些检材由于浓度含量较高、干扰物质少,无需预先进行分离和纯化,可以直接进行仪器分析即可获得满意的结果外,大部分原始检材由于杂质含量高、浓度低,部分成分会对待测物产生干扰,不适合于仪器直接分析测定,需要对原始检材进行处理。经过分离、纯化、浓缩处理后的检材再用仪器对其进行定性和定量分析,其结果的可靠性和准确性将取决于前处理方法的净化能力、提取效率、重复性等。因此,掌握检材处理原理和特点,选择和制定周密的检材处理程序和完成准确无误的操作是非常重要的。

第一节检材处理基本知识

在进行检材处理时,必须考虑的因素有待测物的理化性质、浓度范围、检测目的、检材类型、检材制备与所使用分析仪器设备的联系。目前在微量物证与毒物毒品分析中常用的检材处理技术有蒸馏、溶剂萃取、气体萃取、固相萃取、超临界萃取、衍生化、膜分离、微波辅助提取、微透析等技术,虽然方法众多,但都依据一些基本原理,遵循一些基本原则,存在某些共同的问题,使用一些常用的设备。

一、检材处理的作用与目的

检材处理是对检材中待测组分进行预分离、浓缩、纯化、衍生化等单元操作或组合操作,将待测组分转化为能够适合于仪器分析的形态,是整个分析过程的关键步骤。根据检材的物化性能差异,选择合适的检材处理方法,不仅能够最大限度地发挥仪器的分析测试功能,而且可以得到准确、可靠的结果。

(一)检材处理的作用

公安工作中涉及到的一些检材中所含待测物含量较低(ng/L);一些检材含有大量水分、氧或不利于仪器检测的基体成分,如果不对检材进行处理,就无法得到可靠的仪器检测结果;对含有多种有毒成分的检材进行定量检测时,每一种毒物的仪器检测最佳条件不同,需要对检材在不同条件下进行处理以弥补这些条件的差异而引起的误差。

    1.提高灵敏度和降低检测限。经过提取、净化处理的样品,可以起到浓缩被测痕量组分的作用,从而提高方法的灵敏度,降低最小检测限。如环境样品中有毒有害物质的浓度一般很低,难以直接测定,经过样品前处理富集后,就可用各种仪器分析测定,从而降低测定方法的最低检测限。

2.去除基质与杂质干扰。含有大量复杂基质的样品,必须在仪器分析前将其基质除去,如色谱分析中,生物样品中的大量蛋白质或固相微粒会堵塞色谱通道及色谱柱,应该在进样分析前分离除去。否则基质产生的讯号可以大到部分或完全掩盖痕量被测物的讯号,降低方法的灵敏度;不能与待测组分实现完全分离的干扰性杂质会影响色谱分辨率与重现性。通过前处理方法消除这些干扰将大大提高色谱分析的分离度、重现性和准确度。

3.提高方法的选择性。通过提取、净化处理技术,可以使一些在通常检测器上没有响应或者响应较低的化合物转化为具有很高响应的化合物,如硝基烃在目前各种检测器上响应均较低,利用衍生化法把它还原为氨基烃,再经三氟乙酰衍生化处理后生成带电负性很强的化合物,则在电子捕获检测器(ECD)上具有极高的灵敏度。衍生化通常还用于改变待测物的性质,提高待测物的灵敏度,达到改善方法灵敏度与选择性的目的。

4.有利于环境样品的保存和运输。因为有些检材如环境样品检材浓度低,釆集的量相对较大,不但保存和运输不方便,而且可能使相对稳定的待测组分发生变化,这类检材经提取、净化处理后就变得容易保存和运输,而且可以使待测组分保持相对稳定。

5.延长仪器的使用寿命。通过检材处理可以除去对仪器或分析系统有害的物质,如强酸或强碱性物质、生物大分子等,从而延长仪器的使用寿命,使分析测定能长期保持在稳定可靠的状态下进行。

(二)检材处理必须遵循的原则

1.检材是否需要预处理,如何进行预处理,采样何种方法,应根据检材的性状、检验的要求和所用分析仪器的性能等方面加以考虑;

2. 在检材处理过程中,应尽量减少操作步骤,加快分析速度;

3. 检材的处理过程中所用检材处理装置大小应当与处理的检材量相适应。

4.在检材制备过程中,如果需要将待测组分进行化学反应(如衍生化)转化为另一种测定组分时,这一变化必须是已知的和定量地完成,待测组分的回收率应足够高,不能造成待测组分的损失;

5.在检材处理过程中尽可能减少无关化合物的引入,试剂的消耗应尽可能少,要防止和避免引入待测组分或干扰测定的组分;

6.注意对照检材与空白检材的制备,保证检材前处理方法的可靠性。

(三)导致待测物损失的因素与措施

在检材制备过程中,操作不当或失误会引起待测物的损失,以下是操作过程易引起待测物损失的因素。

1.吸附。玻璃表面或橡胶塞会吸附脂肪胺类及含硫化合物,可采用硅烷化减少玻璃表面的吸附性,在非极性提取溶剂中加入少量极性溶剂可减少器皿对待测物的吸附。血样中红血球和形成的纤维蛋白元凝块,常能引起待测物的共沉淀,可以加入一定离子强度的缓冲液使蛋白质变性,形成疏松的絮状物,使血球散开,待测物可从血球表面解吸,减少待测物共沉淀的损失。

2.化学降解。待测物的化学(光化学)、生物学及热不稳定性易引起待测物分解,应尽量采用温和条件处理检材。

3.衍生化反应。由于衍生化反应不完全,待测物仅部分转化为所需的产物或有副产物生成;有时在蒸发除去过量衍生化试剂时,使得衍生化产物与溶剂形成共沸混合物而导致损失。

4.络合。某些待测物会与重金属离子络合或与酶、受体、血浆蛋白、多糖等内源性大分子相互作用,导致待测物的损失。

5.蒸发。有的是待测物本身的挥发性(如苯丙胺)或因蒸发所得残渣未能完全溶于所加的小体积溶剂中导致损失;或因减压浓缩引起溶液暴沸而导致损失;或使用氮吹仪干燥过程中待测物以气溶胶形式逸出而导致损失。

(四)影响检材处理结果的因素

1.增塑剂的影响。某些塑料采集管含有邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)、三丁氧基乙基磷酸酯(tris(2-butoxyethyl) phosphate,TBEP)等增塑剂,可使溶剂萃取步骤中待测物分配系数发生变化、方法变异系数增大。

2.脂肪酸和酯类的影响。血液检材中含有浓度约为200~300μg/mL的脂肪酸和酯类,较待测物高102~103倍以上,易被有机溶剂萃取,常出现在色谱图中,影响待测物的测定。

3.溶剂的影响。由于萃取或衍生化过程中使用的溶剂量较大,即使原来溶剂中所含杂质浓度较低,在浓缩或通过色谱柱时,杂质浓度会显著增大而干扰测定。更严重的是干扰物在每批溶剂中有所不同,从而影响实验结果,所以溶剂在使用前最好重新蒸馏。

4.清洁剂的影响。实验室器皿洗涤时使用的去污剂未清洗干净,实验装置安装过程中使用的润滑油,称量过程中使用的滤纸,配液所使用的蒸馏水纯度不够等原因都会引起污染。

(五)检材处理过程中常用仪器设备

1.旋转蒸发仪。旋转蒸发仪(图4-1)主要用于在常压或减压条件下连续蒸馏大量易挥发性有机溶剂。尤其是对萃取液的浓缩和色谱分离时接收液的蒸馏,可以分离和纯化待测物。操作时,应注意通过调节真空泵的真空度或者加热锅的温度防止爆沸,也可以通过向检材中加入防沸颗粒防止爆沸,减少实验检材的损失。



2.微波消解装置。微波消解装置(图4-2)通过将检材和消解液置于微波快速加热密闭反应容器中,使检材迅速分解破坏,其中金属元素以离子形式溶于消解液中,形成澄清溶液,满足电感耦合等离子体光谱仪(ICP)、原子吸收分光光度计(AAS)、原子发射分光光度计(AES)等分析仪器的进样要求。

含有大量有机物的生物检材通常采用混酸进行湿法消解,常用的混酸有:HNO3-HClO4、HNO3-HClO3-HClO4、HNO3-HClO4-H2SO4、HNO3-H2SO4、H2SO4-H2O2和HNO3-H2O2



3.索氏提取器。索氏提取器(图4-3)是由提取瓶、提取管、冷凝器三部分组成的,提取管两侧分别有虹吸管和连接管,是一种从固体物质中萃取化合物的方法。将待萃取固体物质放在滤纸套内,置于提取器中,提取器的下端与有溶剂的圆底烧瓶相连,上面接回流冷凝管。加热圆底烧瓶,溶剂蒸气通过提取器的支管上升,冷凝后滴入提取器中,当溶剂面超过虹吸管的最高处时,含有待测物的溶剂虹吸回烧瓶,萃取出一部分待测物,如此重复,使固体物质不断被纯的溶剂所萃取,待测物富集于烧瓶中。



 

4.超临界流体萃取器。超临界流体萃取(supercriticalfluid extraction,SFE)是用超临界流体作为萃取剂,把一种成分(萃取物)从另一种成分(基质)中分离出来的技术。超临界流体萃取设备(图4-4)由萃取和分离两部分组成,在超临界状态下,超临界流体与待分离的物质接触,首先有选择性地将极性大小、沸点高低或分子量大小不同的成分依次萃取出来;再借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体,被萃取物质则完全析出,从而达到分离提纯的目的,最常用的超临界流体是二氧化碳(CO2)。


5.离心机。离心机(图4-5)是利用离心力将悬浮液中的固体颗粒与液体分开,或将乳浊液中两种密度不同,又互不相溶的液体分开的装置。按照分离方式不同可分为过滤式离心机和沉降式离心机两大类。过滤式离心机是通过高速运转的离心转鼓(配有滤材)产生的离心力,将固液混合液中的液相加速甩出转鼓,而将固相留在转鼓内,达到分离固体和液体的效果,或者俗称脱水的效果。沉降式离心机的主要原理是通过转子高速旋转产生的强大离心力,加快混合液中不同比重成分(固相或液相)的沉降速度,把检材中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。实验室中常用的是沉降式离心机,包括常速台式离心机(转速≤3500 r/min)、高速冷冻离心机(转速3500~50000 r/min)、超高速低温离心机(转速>50000 r/min)等。



6.过滤(或抽滤)装置。过滤是在外力作用下使悬浮液或浑浊液中的液体透过介质,固体颗粒及其他物质被过滤介质截留,从而使固体及其他物质与液体分离的操作。根据过滤推动力的不同,又分为重力过滤、加压过滤、真空过滤和离心过滤。实验室常用抽滤与过滤装置如图4-6。


7.冷冻干燥机。冷冻干燥机系统由制冷系统、真空系统、加热系统、电器仪表控制系统组成,是利用升华的原理进行干燥的一种技术,实验室常用冷冻干燥装置如图4-7。被干燥的物质在低温下快速冻结,然后在适当的真空环境下,使冻结的水分子直接升华成为水蒸气逸出。物质在干燥前始终处于低温冻结状态,同时冰晶均匀分布于物质中,升华过程不会因脱水而发生浓缩现象,避免了由水蒸气产生泡沫、氧化等副作用。干燥物质呈干海绵多孔状,体积基本不变,极易溶于水而恢复原状,可防止干燥物质的理化和生物学性质改变,常用于生物检材制备。


8.研钵/粉碎机。为了将固体检材破碎,减小其粒径以有利于其有效成分释放,提高提取效率,或进行粉末状固体的混和,常常需要将固体检材进行研磨或粉碎。

按被研磨固体的性质和产品的粗细程度选用不同质料的研钵。一般情况用瓷制或玻璃制研钵,研磨坚硬的固体时用铁制研钵,需要非常仔细地研磨较少的试样时用玛瑙或氧化铝制的研钵,但玛瑙研钵不能研磨硬度过大的物质,不能与氢氟酸接触。进行研磨操作时,研钵应放在不易滑动的物体上,研杵应保持垂直。大块的固体只能压碎,不能用研杵捣碎,否则会损坏研钵、研杵或将固体溅出。易爆物质只能轻轻压碎,不能研磨。研磨对皮肤有腐蚀性的物质时,应在研钵上盖上厚纸片或塑料片,然后在其中央开孔,插入研杵后再行研磨,研钵中盛放固体的量不得超过其容积的1/3。研钵不能进行加热,尤其是玛瑙制品,切勿放入电烘箱中干燥。洗涤研钵时,应先用水冲洗,耐酸腐蚀的研钵可用稀盐酸洗涤。研钵上附着难洗涤的物质时,可向其中放入少量食盐,研磨后再进行洗涤。若研磨材料用于提取DNA或RNA,用锡纸包裹后于烘箱内180℃灭菌。实验室常用研磨/粉碎装置如图4-8。


9.搅拌装置。搅拌装置(图4-9)是使液体、气体介质强迫对流并均匀混合的设备。实验室中常用到具有加热、温控功能的磁力(加热)搅拌器、电机马达搅拌器、可调高速电动匀浆器、旋涡混合器等,用于检材的均质化。

二、检材处理的基本原理

检材处理是利用待测物与检材基质的物理化学特性差异,使待测物从对检测方法有干扰作用的检材基质中提取分离出来。常利用待测物的极性和挥发性的差异进行检材制备。极性主要影响待测物的溶解性及两相分配系数,如在进行液液提取(liquid-liquidextraction)、液固提取(liquid-solid extraction)等操作时就是利用待测物极性这一理化特性。而挥发性则主要与化合物的蒸汽压有关,在进行吹扫捕集提取(purge-and-trapextraction)、顶空提取(headspace extraction)等操作时就是利用待测物的挥发特性。

(一)分子的极性和水溶性

根据“相似相溶”原理,极性大的化合物易溶于强极性溶剂,极性小的化合物易溶于非极性溶剂;同类分子或官能团相似的物质间彼此互溶。待测物的极性决定其在溶剂中的溶解性,当待测物的极性与溶剂的极性相近时有较大的溶解度,反之则溶解度小。

待测物的极性和在水溶液中溶解性的大小是选择提取和净化条件的重要参考依据,使用与待测物极性相近的溶剂为提取剂,使待测物在溶剂中达到最大溶解度。当极性相近时,在估计化合物的水溶性时还必须考虑其分子的大小、温度、“盐析”作用、表面活性剂、pH值等因素的影响。

1.pH与pKa值。Ka是代表弱酸的电离平衡常数,代表一种酸离解氢离子的能力,其负对数为pKa。作为一个平衡常数,酸度系数Ka通过质子化状态(AH)与脱质子化状态(A-)的自由能差ΔG°来计算。分子的相互作用偏向离子化状态时,离解的能力较强,Ka值增加(pKa值降低),酸性较大。相反,分子作用偏向分子化状态时Ka值会下降,或pKa值增加,酸性减小。

pH是溶液酸碱度的衡量,不但与温度有关,还与溶液浓度有关系。pH和pKa的关系可以通过弱酸(弱碱)的电离平衡常数推导得出:

pH = pKa +log([共轭碱]/[共轭酸])

pKa=-lgKa ,pH=-lg[H+]

当比值 [共轭碱]/[共轭酸]=1 时,pH = pKa

pH值可以改变具有酸性或碱性官能团的有机物的离子化或质子化程度,决定了待测物的存在方式。一般来讲,酸性有机物在酸性条件下(pH小于其pKa 值2个单位)主要以分子型(99%)状态存在;碱性有机物在碱性条件下(pH 值大于其 pKa 值 2个单位)以分子型状态(99%)存在,分子状态与有机相的作用力大,在有机溶剂中的溶解度大,而在水中的溶解度低。如甲基苯丙胺的pKa=9.9,在pH>11时,溶液中甲基苯丙胺主要(99%)以分子状态存在,在有机溶剂中溶解度大,可在该pH条件下采用有机溶剂进行提取。

2.分子极性。分子极性常用分子的偶极矩和介电常数两个参数来描述,反映的是分子内电荷分布的不均匀性。但由于分子的极性受到氢键、范德华力等因素的影响,还与分子中π电子数和孤对电子数密切相关,因此单凭偶极矩和介电常数不能对其极性高低作出正确判断。通过对一个化合物分子结构的分析只能大致知道其极性的强弱,而没有一个确定的数值,也没有单一的指标来界定分子的“极性”。一般来说,对称化合物的极性比非对称化合物的弱,对称取代化合物的极性比其非对称取代异构体的极性弱。

常用溶剂的极性顺序为:乙酸>吡啶>水 >甲酰胺>甲醇> 乙腈>乙醇> 丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚> 异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油。

(二)分配定律

分配定律(distribution law)是指在互不相溶的极性和非极性溶剂系统中,由于物质在两相中的溶解度不同,在一定条件下,当达到平衡时,物质在该两相中的浓度比为一常数,即:

KD = [A]非极性相/[A]极性相

KD称为分配系数(distributioncoefficient),其值大小与溶质及溶剂的性质及平衡时的温度等条件有关,而与相体积无关。KD值越大,存在于非极性溶剂中的待测物越多,越有利于用该非极性溶剂提取待测物,而KD值越小,则存在于极性溶剂中待测物越多,越有利于用该极性溶剂提取待测物。

常使用的两相溶剂体系有:(1)水不溶溶剂-水(如正辛醇-水、乙酸乙酯-水、氯仿-水、石油醚-水等);(2)已烷-极性有机溶剂(如已烷-乙腈、已烷-二甲基甲酰胺、已烷-二甲基亚砜);(3)石油醚-极性有机溶剂(如石油醚-丙酮、石油醚-乙腈、石油醚-二甲基甲酰胺、石油醚-二甲基亚砜)等。

(三)挥发性和蒸气压

挥发性是指液态或固态物质转变为气态的物理性能,可用沸点和蒸汽压两个参数来表示。物质在沸点以外温度的挥发性主要采用蒸汽压这个参数。挥发性大小决定了物质在气液或气固两相中的分配数量多少。

温度(T)对蒸汽压(P)有强烈影响,蒸汽压随温度的升高而增加,logP与T呈线性正相关。蒸汽压高的化合物,在蒸发浓缩时,尤其是当把溶剂完全除去时,极容易损失掉,但有利于吹扫共馏法(sweep co-distillation)、吹扫捕集提取等使用强制挥发原理建立的提取方法。

一个化合物在水中的挥发性能是与蒸汽压和水溶性二者相关的函数。亨利定律(Henry law)就是描述在等温等压条件下,某种气体在溶液中的溶解度与液面上该气体的平衡压力成正比。这个比值就称作亨利常数(Henry constant),它真实地显示化合物在水溶液中的挥发性能。蒸汽压越高挥发性能越大,而水溶性越强则挥发性能越小。对于一些中等蒸汽压,但水溶性非常低的化合物,室温操作必须特别小心,否则很容易挥发损失掉,以致无法得到正确的分析结果。

第二节常用检材处理技术

接受任何检材后,要根据待测物的性质和检测仪器的要求,采用物理、化学的方法处理检材,将其制备成适合仪器进样要求、仪器方法分离能力(能将待测物和其他组分分离开)、仪器方法检测能力(检测限以上)的样本进行分析。检材处理方法有溶剂萃取、固相萃取、蒸馏、膜分离、吸附-热解吸等方法,对某一样本的制备可能使用其中一种处理技术,也可能同时使用其中的几种技术,需要根据该样本制备的需求决定。

在处理检材时,要注意防止待测物的丢失,还要注意化学反应的收率和有无副反应发生。为此,最好平行取两份检材,同时制备两个分析用样本,以保证样本制备的可靠性。也可取两份检材后,在其中的一份中加入已知量的待测物作为对照,同时制备这两个样本,以计算样本制备的回收率。在样本制备时还要注意所使用的装置、容器、化学试剂、水等检材所能接触的物品是否会带来污染,因此要作空白实验,以检验样本制备过程是否引入了对测定有干扰的物质。

使用何种技术处理检材,除了主要考虑整个检材和待测组分的物理化学性质以及所要使用的仪器对样本的要求外,也要考虑制备所需要的时间和费用,在能满足仪器分析需要的前提下,选用最简单和最经济的制备技术。

一、溶剂萃取

溶剂萃取是指利用化合物在两种互不相溶(或微溶)的溶剂中溶解度或分配系数的不同,使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中,经过反复多次萃取,将绝大部分的目标化合物提取出来的方法。检材处理中使用的溶剂萃取方法主要有液-液萃取、液-固萃取和液-气萃取(溶液吸收)。

(一)液-液萃取

液-液萃取是利用检材中各组分在不混溶的由两种或多种溶剂形成的两相中溶解度或分配比的差异进行分离、纯化和消除干扰物质的过程。大部分情况下,一种液相是水溶剂,另一种液相是有机溶剂。通常使用具有较高蒸气压的有机溶剂萃取分离待测物,萃取后可以通过蒸发的方法将溶剂除去,浓缩待测物。所使用的溶剂不仅需要具有选择性的溶解能力,而且必须有好的热稳定性、化学稳定性、较小的毒性和腐蚀性。

1.液-液萃取基本理论。如果以有机溶剂和水两相为例,将含有有机物质的水溶液用有机溶剂萃取时,有机化合物就在这两相间进行分配。在一定的温度下有机物在两种液相中的浓度比是一常数:

K = Co/Caq

式中,K是分配系数,Co是有机相中待测物的浓度,Caq是水相中待测物的浓度。有机物质在有机溶剂中的溶解度一般比在水相中的溶解度大,所以可以将它们从水溶液中萃取出来。分配系数越大,水相中的有机物可被有机溶剂萃取的效率越高。但是,在多组分检材体系中这些物质的分配系数差别较大,使用一次萃取不可能将全部物质从水相转移至有机相,常常需要多次萃取。常用萃取效率(E)表示待测物的萃取情况:

E= CoVo/(CaqVaq+CoVo)= KV/(1+ KV)

式中,Vo为有机相体积,Vaq为水相体积,V=Vo/Vaq为相比。

对于一步萃取,为了获得较大的萃取效率(>99%),分配系数K必须大于10,因为相比(Vo/Vaq)必须保持在0.1~10 之间。

对于每次使用相同体积溶剂进行多次萃取效率如下式:

E=1-[1/(1+ V/K)]n

式中,n 是萃取次数。一般来说,多次萃取与一次萃取相比具有较高的萃取效率。

若检材中含有A、B两种组分,则组分A的分配系数对组分B的分配系数的比值,即A对B的分离因子,称为选择性系数α,即:

α=KA/KB=(CoA·CaqB)/(CaqA·CoB)

当α>>1时,组分A被优先萃取;α=1表明两组分在两相中的分配相同,不能用该萃取剂实现该两组分的分离。 

溶液的pH值、待测物的性质、溶剂的性质以及温度等参数变化,会改变待测物在两相中的分配系数,从而改变选择性和萃取效果。

2. 液-液萃取溶剂的选择。溶剂选择标准主要与待测物的溶解性和极性有关,选择可使待测物获得最大K值的纯溶剂或者混合溶剂。有机溶剂的性质,有机溶剂的结构、极性等性质会影响其与待测物的作用力大小。待测物与有机溶剂具有相似的极性、相似的官能团或相似的结构则相互作用力强,萃取效率高;此外溶剂与待测物的氢键作用力也是影响萃取效率的因素。

在液-液萃取中,应该选择在水中溶解度小于10%、萃取后易挥发、与分析技术匹配的、与待测物作用力大的有机溶剂。能够与水混溶的低分子量醇、酮、醛等有机试剂,不适合于液-液萃取。此外,待测物被转移到哪一相中,取决于选择的条件。可以通过调节pH 值、使用离子对或盐析方法使待测物处于离子态或分子态,来调节待测物或干扰物处于哪一相中,达到分离提纯的目的。

萃取时,除了考虑溶剂的选择性和极性之外,还要考虑操作的难易程度和分析时间长短。例如,萃取水检材中的待测物时,除考虑水的亲和性、密度、形成乳浊之外,还要考虑萃取后的精制操作和色谱检测器的响应等,这样可以使分析时间大为缩短。

3.液-液萃取基本设备。液-液萃取通常使用分液漏斗作为萃取器皿。操作时应当选择容积较液体检材体积大1倍以上的分液漏斗,一般情况下,溶剂体积约为检材溶液的30%~35%。为了增加两相之间的接触和提高萃取效率,应振荡分液漏斗。在操作过程中注意放气和静置,待分液漏斗中两层液相完全分开后,打开上面的瓶塞,将下层液体自活塞放出。有时在两相间可能出现一些絮状物也应放出,上层液体从分液漏斗的上口倒出,切不可也从活塞放出,以免被残留在分液漏斗中的第一种液体所玷污。萃取次数取决于待测物在两相中的分配系数,一般为3~5 次。将所有的萃取液合并,加入合适的干燥剂干燥、蒸发浓缩后备用。

如果待测物的K值较小或者需用较大的检材量,则需要进行多次萃取,这时萃取液的总体积太大。对于萃取动力学很慢的体系,需要很长时间才能建立萃取平衡。在这些情况下,可以使用连续液-液萃取技术。

在连续液-液萃取中(图4-10),一般使用比水重的有机溶剂进行萃取。萃取溶剂从烧瓶中被加热蒸发,上升到冷凝器被冷凝流入到检材中,并分离出水和带有萃取物的溶剂。溶剂和萃取物返回到烧瓶中,新鲜的有机溶剂可以循环连续使用。此过程连续地进行直到足够量的待测物被萃取出来,烧瓶也作为浓缩器使用,连续萃取之后用于蒸发和除去萃取溶剂。高挥发性、热不稳定化合物可能会在蒸馏过程中损失或降解。



 

对于分配系数K值极小的化合物,可以使用逆流萃取(countercurrent distribution),即含有待测物的水相及有机相分别从萃取器的两端流入,以相反方向流动,进行连续多次接触分层而达到分离的目的。

传统的液-液萃取需要大量的手工操作,许多仪器厂家研制了全自动或者部分自动的检材萃取和浓缩装置(图4-11)。这种自动系统大多应用于液体易于分散和混合的体系。

 

4.液-液萃取常用破乳方法。液-液萃取过程中需要急速地振动分液漏斗,此操作有助于两相完全接触,有利于物质传递。但由于检材和溶剂剧烈的振动,会出现乳化现象,特别是含有表面活性剂和脂肪的检材。为了防止乳化的形成,应采取加热、加盐、使用缓冲溶液、调节pH值、调节离子强度等方法。

对于脏器、血液等生物检材,先在研钵中加入等量的无水硫酸钠与检材同时研磨,直至干沙状后,经有机溶剂萃取就不会发生乳化现象,而且可获得较高的萃取效率;对于生物检材,常用酸性乙醇浸取法、三氯乙酸沉淀蛋白法、冷冻除油脂法等除掉检材中的蛋白、脂肪等乳化物。此外,采用缓慢振摇,可有效地防止乳化。

对于高度乳化检材,可采用离心法破乳,破乳率随离心转数的增加而增大,也随作用时间的延长而增大,通常采用2000r/min,作用2min后的破乳率可达100%,但不适用微乳液的破乳。也可以采用无水硫酸钠研磨法破乳,将乳浊液转入研钵中,使用无水硫酸钠研磨至沙状后再进行萃取可消除乳化现象。还可以采用蒸干法,将乳浊液置入蒸发皿中,于100℃沸水浴蒸干后,再用有机溶剂萃取,但不适用于挥发性物质的萃取。

对于中度乳化检材,可加入电解质破乳。对于两相比重相近引起的乳化,可通过加入可溶解性氯化钠于水相中,提高体系中水相的比重使两相分层。破乳率与加入电解质的量成正比,如果仍然不能分层,可加入1mol/L的盐酸消除乳化;对于两相比重相差较大形成的乳化,加入无水乙醇能溶解相互粘合的两相液滴,破乳的效果也比较好,此外,将乳浊液经过无水硫酸钠漏斗过滤也可以完全地消除中度乳化。

对于轻度乳化检材,可使用玻璃棒搅动乳化层,削弱乳化物分子的吸附作用;或者使用细金属丝与容器壁摩擦,破坏胶体粒子的双电层。由于乳浊液是液体杂质以微小珠滴分散于液体溶剂中的一种分散体系,是热力学不稳定体系,静置一定的时间后,可自然分层,此种方法比较费时间,但是不会引入杂质。

(二)液相微萃取

               :用细内容 射)光谱仪、电感耦合等离子体光谱仪等色谱、光谱仪器进液相微萃取(liquid phase microextraction,LPME)技术是与色谱系统联用的一种检材前处理技术。该技术使传统的液相萃取技术小型化,用极小的溶剂体积(几至几十微升)替代了原来几百倍的溶剂体积,具有快速、经济、易于实现自动化等特点。

 1.悬滴液相微萃取(single-dropmicroextraction,SDME)。液相微萃取最初的形式是将一滴有机溶剂悬挂在色谱微量进样器针头或Teflon棒端,然后浸入含水样品溶液中进行萃取(图4-12)。这是典型的两相系统,即给体(donorphase)-含水样品溶液与受体(acceptorphase)-有机液滴两相。根据目标分析物在两相间分配系数的差异,由含水样品溶液萃取至有机液滴中,然后有机液滴抽回到色谱微量进样器,直接进行气相色谱分析。也可以设计成三相系统,液滴为水相,用于液相色谱或毛细管电泳分析。这种方法一般比较适合于萃取较为洁净的液体样品。因为此技术中悬滴容易脱落或发生损失,重现性较差。

 2.中空纤维液相微萃取(hollow-fibers LPME,HF-LPME)。由于悬在色谱微量进样器针头上的液滴在样品搅拌时易于脱落,为了增强液滴的稳定性和可靠性,1999在此基础上首次提出了以多孔中空纤维为萃取溶剂( 接收相) 载体的液相微萃取技术(hollow fiber liquid-phase microextraction,HF-LPME),包括两相模式或三相模式的液-液微萃取或液-液-液微萃取(图4-13)。该技术将多孔性的聚丙烯中空纤维固定在进样器的针头上,用于保护和容纳萃取溶剂,同时由于纤维上的多孔性,增加了溶剂与样品接触的表面积,提高了萃取率。

中空纤维的内径通常为600~1200μm,壁厚为200μm,使用长度多为1.5~250px,可容纳4~110μL萃取溶剂(受体溶液)。纤维孔隙尺寸一般为0.2μm,这样小的孔径可强有力地固定有机溶剂以确保在萃取过程中有机溶剂不会渗漏,尤其是在为提高萃取效率而进行剧烈搅拌和用于可使有机溶剂乳化的样品(如血浆)时。

3.分散液相微萃取( dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)。2006年首次报道的分散液相微萃取技术的萃取过程如图4-14所示。在带塞的离心试管中加入一定体积的水溶液,将含有萃取剂的分散剂通过注射器或移液枪快速地注入离心试管中,轻轻振荡,从而形成一个水/分散剂/萃取剂的乳浊液体系;形成乳浊液之后,萃取剂被均匀地分散在水相中,与待测物有较大的接触面积,待测物可以迅速由水相转移到有机相并且达到两相平衡,通过离心使分散在水相中的萃取剂沉积到试管底部,用微量进样器吸取一定量的萃取剂后直接进样测定。

 


分散液相微萃取只适用于亲脂性高或中等的待测物(K>500),对于高度亲水的中性分析物,是不适用的;而对于具有酸碱性的分析物,可通过控制样品溶液的pH值使分析物以非离子化状态存在,从而提高分配系数。

(1)萃取剂。萃取剂需满足两个条件:一是其密度必须大于水,这样才能通过离心的方法把水溶液与萃取剂分离;二是萃取剂要不溶于水而且对待测物的溶解能力要大,以保证取得良好的萃取效率。卤代烃的密度都比较大,所以一般都选用卤代烃为萃取剂,如卤苯、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷及四氯乙烷(烯)等。随着所加萃取剂体积的增加,最后离心得到的有机相体积也随之增加,使有机相中待测物的浓度降低,富集倍数下降,方法的灵敏度也随之降低。因此通常采用0.001~0.01范围的相比值(V)进行萃取,有机溶剂使用量一般为5~100μL。

(2)分散剂。要求分散剂不仅在萃取剂中有良好的溶解性而且能与水互溶。这样可以使萃取剂在水相中分散成细小的液滴,均匀的分散在溶液中,形成一个水/分散剂/萃取剂的乳浊液体系,增大萃取剂与待测物的接触面积,从而提高萃取效率。常用的分散剂包括甲醇、乙醇、丙酮、乙腈及四氢呋喃等。分散剂体积直接影响/水/分散剂/萃取剂乳浊液体系的形成,影响萃取剂在水中的分散程度的高低,从而影响萃取效率,一般加入0.5~1.5 mL分散剂。

(3)萃取时间。萃取时间对分散液相微萃取效率没有显著的影响,这是由于在溶液形成乳浊液之后萃取剂被均匀地分散在水相中,待测物可以迅速由水相转移到有机相并达到两相平衡。

(6)盐浓度。一般通过调节萃取用溶剂的极性或者酸碱性,可实现选择性萃取,减少基质干扰,随着离子强度的增加待测物物和有机萃取剂在水相中的溶解度减小,利于提高回收率;同时所得有机相的体积增加,有机相中待测物浓度降低,富集倍数显著下降。

液相微萃取技术集萃取、纯化、浓缩于一步,提高了提取效率,可以采用检材加入内标和萃取校正标准的方法进行定量测定。

(三)液-固萃取

液-固萃取也叫浸取,最简单的液-固萃取就是将欲萃取的固体放入萃取溶剂中,加以振荡,必要时也可加热,利用离心或过滤的方法使液、固分离,待测组分进入溶剂相。但是,该方法萃取效率低,加热时溶剂也容易损失,只能用于十分容易萃取的组分,一般很少使用。

液-固萃取过程包括固体检材中待测组分分子在溶剂中的溶解过程和待测组分分子与溶剂分子相互扩散的过程。扩散过程主要由分子扩散和对流扩散组成,在固体检材表面与溶剂接触处为分子扩散,而远离固体检材表面处为对流扩散,在对流扩散中也有分子扩散。影响分子扩散的主要因素有温度、被萃取物质的分子大小和液体介质的黏度;影响对流扩散的主要因素有流动液体的速度、状态、液体的黏度、检材表面的性质等。

对于像残渣、土壤和生物等固体检材的萃取,可以采用丙酮、乙腈等强极性溶剂,但是强极性溶剂常常将检材中的油分、色素等溶出而干扰测定。应当尽量采用萃取重现性好而干扰物质不易萃取的溶剂,这样可使后续的操作简化。此外,对于含有水分的固体检材,萃取溶剂中还应加入一些水分,放置过夜,以提高萃取效率。使用没有吸附性的精硅藻土作为助滤剂,可使过滤变得容易。

常用的液-固萃取设备是索氏萃取仪,通过K-D浓缩器完成萃取和浓缩程序,最后可将检材萃取液浓缩至1~5mL。

    二、固相萃取

固相萃取(solid phase extraction,SPE)是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相色谱法分离原理,主要用于复杂检材中微量或痕量待测物的分离、纯化、富集、浓缩。固相萃取仪及固相萃取小柱如图4-14所示。

(一)普通固相萃取

1.固相萃取基本过程。固相萃取的一般过程是使液体检材通过吸附剂,保留其中待测物,再选用适当强度的溶剂冲去杂质,再用洗脱液洗脱或加热解吸附回收待测物;也可选择性吸附干扰杂质,而让待测物流出;或同时吸附杂质和待测物,再使用合适的溶剂选择性洗脱待测物。如果选择对待测物吸附很弱或不吸附,而对干扰化合物有较强吸附的吸附剂时,可让待测物先洗脱下来加以收集,而使干扰化合物保留(吸附)在吸附剂上,两者得到分离。多数的情况下是使待测物保留在吸附剂上,最后用强溶剂洗脱,这样更有利于检材的净化。

2.固相萃取基本模式。固相萃取所用吸附剂与液相色谱常用的固定相相同,其主要分离模式也与液相色谱相同,分为正相(吸附剂极性大于洗脱液极性)、反相(吸附剂极性小于洗脱液极性)和离子交换吸附。常用于填充的固相分离物质有氧化铝、活性碳、硅藻土、离子交换树脂、聚苯乙烯或C18化学键合硅胶等,粒径分布一般在40μm左右。

(1)正相固相萃取。正相固相萃取所用的吸附剂都是极性的,用来萃取(保留)极性物质。待测物如何保留在吸附剂上,取决于待测物的极性官能团与吸附剂表面的极性官能团之间的相互作用,其中包括了氢键π-π键相互作用、偶极-偶极相互作用和偶极-诱导偶极相互作用以及其他的极性-极性作用。正相固相萃取可以从非极性溶剂检材中吸附极性化合物,通常用待测物所在的有机溶剂(检材基体)进行洗脱。

(2)反相固相萃取。反相固相萃取通常使用非极性或极性较弱的吸附剂,所萃取的待测物通常是中等极性到非极性化合物,待测物与吸附剂间的作用主要是色散力。通常用水溶性有机溶剂甲醇洗脱,然后用水或缓冲溶液洗脱。也可以在用甲醇洗脱之前先用非极性溶剂己烷洗脱,以消除吸附剂上吸附的杂质及其对待测物的干扰。

(3)离子交换固相萃取。离子交换固相萃取所用的吸附剂是带有电荷的离子交换树脂,所萃取的待测物是带有相反电荷的化合物,待测物与吸附剂之间的相互作用是静电吸引力。为了使固相萃取小柱中的吸附剂保持湿润,活化处理后应在吸附剂上保持大约1mL活化处理用的溶剂。用于非极性有机溶剂中的检材时,可用检材溶剂来洗脱;用于极性溶剂中的检材时,可用水溶性有机溶剂洗脱后,再用适当pH值、并含有一定有机溶剂和盐的水溶液进行洗脱。

3.固相萃取剂及萃取模式的选择。固相萃取中吸附剂(固定相)的选择主要是根据待测物的性质和检材基体(即检材溶剂)的性质。待测物的极性与吸附剂的极性非常相似时,可以得到待测物的最佳保留(最佳吸附)。两者极性越相似,保留越好(即吸附越好),所以要尽量选择与待测物极性相似的吸附剂。例如萃取碳氢化合物(非极性)时,要采用反相固相萃取(此时是非极性吸附剂)。当待测物极性适中时,正、反相固相萃取都可使用。

吸附剂的选择还受检材的溶剂强度(即洗脱强度)的制约。检材溶剂的强度相对该吸附剂应该是较弱的,弱溶剂会增强待测物在吸附剂上的保留(吸附)。溶剂强度在正、反固相萃取中的顺序是不同的,如果检材溶剂的强度太强,待测物将得不到保留(吸附)或保留很弱。例如检材溶剂是正己烷时用反相固相萃取就不合适了,因为正己烷对反相固相萃取是强溶剂,待测物将不会吸附在吸附剂上;当检材溶剂是水时就可以用反相固相萃取,因为水对反相固相萃取是弱溶剂,不会影响待测物在吸附剂上的吸附。

选择固相萃取分离模式和吸附剂时还要考虑待测物在极性或非极性溶剂中的溶解度,这主要涉及洗脱液的选择;待测物在一定pH值下是否会离子化,是否采用离子交换固相萃取;待测物是否会与吸附剂形成共价键,不利于洗脱;待测物与非待测物在吸附剂上的竞争程度大小,这关系到是否有利于分离待测物。

 

4.固相萃取特点。与液-液萃取相比,因采用高效、高选择性的吸附剂(固定相),固相萃取能显著减少互不相溶的溶剂用量,处理过程中不会产生乳化现象,简化了检材的预处理过程,同时所需费用也有所减少,其缺点是待测物的回收率和精密度低于液-液萃取。

(二)固相微萃取

固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)是在固相萃取上发展起来的一种新型、高效的检材预处理技术,它集采集、浓缩于一体,操作时间短,检材量小,无需萃取溶剂,在检材中加入适当的内标进行定量分析时,其重现性和精密度都非常好。

1. 固相微萃取基本装置与操作。固相微萃取装置外形如一只微量进样器(图4-15),由手柄和萃取头两部分构成,手柄用于安装或固定萃取头。萃取头是一根长25px,涂有不同吸附剂的石英纤维,接在不锈钢丝上。为了保护石英纤维不被折断,外套一细不锈钢管,纤维头在钢管内可伸缩或进出,细不锈钢管可穿透橡胶或塑料垫片进行取样或进样。

固相微萃取的采样方法是将固相微萃取针管(不锈钢套管)穿过检材瓶密封垫,插入检材瓶中。然后推出萃取头,将萃取头浸入检材(浸入方式)或置于检材上部空间(顶空方式),进行萃取。萃取时间大约2~30min,以达到待测物吸附平衡为准。最后缩回萃取头,将针管拔出。

固相微萃取可用于气相色谱,也可用于液相色谱。用于气相色谱时,是将固相微萃取针管(不锈钢套管)插入GC 进样口,推进手柄杆,伸出纤维头,利用进样口的高温热解吸待测物,解吸后待测物被载气带入色谱柱。用于HPLC时,是将固相微萃取针管(不锈钢套管)插入HPLC接口解吸池,利用HPLC的流动相通过解吸池洗脱待测物,并将待测物带入色谱柱。

 

2.影响固相微萃取的因素。固相微萃取的萃取过程是一个平衡过程,萃取的平衡时间与搅拌速度、固定相的膜厚以及被分析检材的分配常数、扩散系数、萃取温度有关。大分子质量的物质比小分子质量的物质需更长的分析时间,搅拌有利于减少达到平衡所需时间。影响固相微萃取灵敏度的因素很多,但萃取头涂层种类和厚度对灵敏度的影响最为关键。一般来说,不同种类待测物要用不同类型的吸附质涂层进行萃取,其选择基本原则是“相似相溶原理”,用极性涂层萃取极性化合物,用非极性涂层萃取非极性化合物。

三、顶空萃取(气体萃取)

 顶空萃取技术是气相和液相色谱法中一种方便快捷的检材前处理方法,通过对检材基质上方气体成分的测定来分析这些组分在原检材中的含量,是一种用气体作“溶剂”来萃取检材中的挥发性成分的间接分析方法,也称为气体萃取,常与气相色谱分析联用。其基本理论依据是在一定条件下气相和凝聚相(液相或固相)之间存在着分配平衡,气相的组成能反映凝聚相的组成。作为一种分析方法,由于只取气相部分进行分析,大大减少了检材基质对分析的干扰,是一种理想的检材净化方法。

根据气体萃取的方式不同,顶空技术分为静态顶空分析和动态顶空分析两类。

  (一)静态顶空技术

静态顶空也被称为“一步气体萃取法”,是在一个密闭的容器中,使检材与检材上方气体达到平衡,然后直接抽取检材上方气体进行分析测定的技术,可用于气体、液体或者固体中挥发性物质的分离。

静态顶空分析分为两步:第一步,将液体检材或者是固体检材放在一个密闭的玻璃检材瓶中并保持检材上方留有一半以上的气体空间,在一恒定的温度下使检材与检材上方的空间气体两相达到平衡。第二步,检材瓶中的两相达到平衡之后,使用气密性注射器抽取检材瓶中顶空的气体,直接注入到色谱中,进行色谱分离和测定。静态顶空分析技术(简称顶空进样技术)主要用于测量在200℃下可挥发的待测物,以及比较难于进行前处理的检材。

静态顶空定性分析非常简便,但是定量测定比较繁杂,除了保证顶空瓶内检材的平衡时间和温度外,一般需要通过内标法保证定量结果稳定可靠。

1. 静态顶空仪器模式。静态顶空分析法在仪器模式上可分为顶空气体直接进样模式、平衡加压采样进样模式、加压定容采样进样模式三类。

顶空气体直接进样模式。由气密进样针取样,一般在气体取样针的外部套有温度控制装置。静态顶空模式具有适用性广和易于清洗的特点,适合于含量较大的三氯甲烷、四氯化碳、三氯乙烯、四氯乙烯、三溴甲烷等挥发性有机物分析。加热条件下顶空气的压力太大时,会在注射器拔出顶空瓶的瞬间造成挥发性成分的损失,因此在定量分析上存在一定的不足。为了减少挥发性物质在注射器中的冷凝,应该将注射器加热到合适的温度,并且在每次进样前用气体清洗进样器,以便尽可能地消除系统的记忆效应。

平衡加压采样模式。由压力控制阀和气体进样针组成,待检材中的挥发性物质达到分配平衡时对顶空瓶内施加一定的气压将顶空气体直接压入到载气流中。这种采样模式靠时间程序来控制分析过程,所以很难计算出具体的进样量。但平衡加压采样模式的系统死体积小,具有很好的重现性。同样为了减少挥发性物质在管壁和注射器中的冷凝,应该对管壁和注射器加热到适当的温度,而且在每次进样前用气体清洗进样针。

加压定容采样进样模式。由气体定量环、压力控制阀和气体传输管路组成,该系统靠对顶空瓶内施加一定的气压将顶空气压入到六通阀的定量环中。然后用载气将六通阀定量环中的待测成分进到色谱柱中。这种方法的优点是重现性很好,很适合进行顶空的定量分析。但由于系统管路较长挥发性物质易在管壁上吸附,因此一般将管路和注射器加热到较高的温度。

2.影响静态顶空分析的因素

 (1) 温度。提高检材温度不会增加体系中所有化合物的灵敏度,但检材中某些组分可能会发生热分解或者被顶空瓶中的空气氧化。例如当温度升高时,乙醇和甲乙酮的灵敏度增加的幅度较大,而甲苯、正己烷的灵敏度增加的幅度很小或者没有变化。顶空进样器的温度设置原则是:测定单组分时根据被测组分的沸点设定;测定多组分时要根据高沸点组分设定,要高于沸点平均值,但不能高于色谱柱的最高使用温度,否则会使固定液流失。

(2) 溶剂。顶空瓶中的蒸气压是检材中所有物质的分压之和。如果检材是液体,那么溶剂的蒸气压决定了顶空瓶中的压力,而溶解的溶质的蒸气压(分压)非常小,与溶剂的蒸气压相比可以忽略。特别是,如果溶剂的沸点比较低时,它在顶空瓶中的压力就更大。所以,在选择溶剂时应当优先考虑那些沸点较高的溶剂,在加热前要了解所用溶剂在对应温度下的饱和蒸汽压。

如果顶空瓶中的蒸气压过大,在使用注射器抽取检材时就会遇到困难,不会得到较好的重复性并会产生很大的测定误差,还可能引起检材泄漏或者顶空瓶损坏。

(3)检材体积和组成。同一检材的体积增大,测定的灵敏度增加。但是,如果检材中的组成发生改变时,可能会对这一检材中的某些组分的灵敏度产生影响。例如,加入2g 氯化钠的检材中1,4-二氧环己烷的测定灵敏度增高,而环己烷的灵敏度基本没有改变。

(4)顶空瓶。顶空分析要求顶空瓶的质量要足够好,瓶体积要准确恒定,瓶口及其边缘要平并且没有刮痕和沟槽,密封垫及其铝帽要有足够的密封性能。顶空分析使用的检材瓶体积尺寸比较多,商品仪器通常都使用自己配套的专用尺寸,一般不能用其他途径得到的检材瓶替换。

顶空瓶中检材与检材上方的气体体积的比值(相比)决定了顶空分析的灵敏度,而不是瓶体积。检材瓶体积的选择通常可依据分析检材的浓度范围、使用仪器的灵敏度和使用分离柱的柱容量来决定。液体检材的顶空分析通常使用的检材瓶体积较小,检材量比较少可缩短平衡时间。一般使用填充柱气相色谱允许的进样量为0.5~2mL,所以应当使用较大的顶空瓶;使用毛细管气相色谱允许的进样量为25~250μL,使用较小的顶空瓶就足够了。

顶空分析中,检材瓶中的两相必须达到平衡时才能进行气相色谱测定。两相之间达到平衡时所需要的时间取决于挥发性组分在两相之间的扩散速率。对于一个未知的检材,需要对平衡时间进行实验研究,在恒温条件下,绘制出时间-峰面积的曲线图。色谱测定的峰面积基本不变时的最短的时间就是平衡时间。如果对顶空检材的恒温时间继续加长,色谱测定的峰面积基本不变。

 (二)动态顶空技术(连续气体萃取技术)

静态顶空方法的主要缺点是有时必须进行大体积的气体进样,检材的蒸汽体积过大,导致挥发性物质的色谱峰的初始展宽较大,影响色谱的分离效能;特别对于组成复杂的检材,这种进样方式限制了高效毛细管色谱柱的使用,蒸汽中大量水分也往往有损于色谱柱的寿命。

应用气相色谱方法测定挥发性有机物时常常利用动态顶空技术对检材进行预处理。动态顶空技术是一种“连续气体萃取技术”或“吹扫-捕集技术”,在一定温度下使用高纯氦气或者氮气等惰性气体,以恒定的流量通过鼓泡方式对检材进行吹扫,从检材基质中吹扫出来的挥发性物质被输送到捕集阱中被吸附阱捕集并浓缩,再通过热解吸释放出这些组分,进行气相色谱分析测定。捕集阱主要由吸附管和制冷剂组成,通常是在常温条件下进行捕集,吸附管内可填充一定量的吸附材料。由于使用连续地吹扫检材并将顶空气体输送出去,检材上方的气体不断地被除去,所以检材瓶中的两相不会达到平衡,这样,检材中挥发性物质就会完全地被吹扫出去。动态顶空具有较高的灵敏度,测定的检出限可达10-12水平,但受捕集阱中吸附剂种类及其填充量的影响。

吹扫-捕集技术中,浓缩技术是整个分析过程的关键所在。目前的发展趋势是:吹扫-捕集技术的优化问题、如何确定检材的浓缩倍数、如何选择有效的捕集吸附剂、气相色谱进样的接口技术问题、如何选择分析测定用的分离柱等。为了对下一个检材进行吹扫-捕集处理,捕集管需要进行清洗以排除由于检材可能残存而引进测定误差。通常采用升高温度和高纯载气吹扫的方法对吸附捕集管进行清洗,载气的流动方向与热解吸时的流动方向相反,此过程叫做“烘烤清洗”,一般烘烤时间为5min以上,如果烘烤时采用载气的流动方向与热解吸时载气流动的方向相同,那么就需要在较高的温度下烘烤较长的时间,可在色谱测定检材的过程中同时进行。

1.萃取效率。使用吹扫-捕集方法对检材中挥发性物质进行气体萃取,待测物的萃取效率可由下式计算出:


在恒定的萃取体积、检材体积和萃取温度条件下,应用Henry定律常数可以预测某一待测物的萃取效率。捕集效率与待测化合物的蒸气压、使用的吸附材料比表面积、待测化合物与吸附材料之间的作用等有关,通常在较低的温度下,吸附材料对化合物的吸附捕集效率会得到改善。为了减少和防止吸附管穿透,浓缩捕集的温度应当保持在25℃±2℃,不能超过30℃。在常温条件下捕集某些化合物时,可以使用液氮作为制冷剂来降低吸附阱的温度。

2.影响萃取效率的因素

检材温度和萃取总体积影响萃取效率,特别是在检材中添加极性大的物质时,吹扫气体流量的作用会变得很明显。在恒定的流速下,增加吹扫气体流量可以提高沸点在35℃以下待测物的萃取效率,但是,这些气体分子可能会因为吹扫气体流量的增加而通过捕集阱,捕集效率会降低。难于吹扫的那些物质可以通过增加吹扫气体的流量或者增加吹扫时间以获得较大的萃取效率。对固体检材的分析,检材应当加热到40℃,实验室环境温度的波动可能会导致分析的相对标准偏差达到50%。通过对固体检材的搅拌可以使检材更均匀一致,提高挥发性物质的吹扫-捕集萃取效率。

四、蒸馏

蒸馏是根据液体混合物中各组分的饱和蒸气压差别,从混合液体检材中分离出挥发性和半挥发性组分的过程。蒸气和液体通过连续反向运动,挥发性和半挥发性的组分富集在气相中而不挥发性组分富集在液相中,挥发性和半挥发性组分因此被分离。实际检材常常是非理想的混合物,各组分之间由于其组成、温度和结构不同,挥发性差别很大。

在蒸馏过程中,蒸气向上运动到蒸馏柱中被冷凝下来,然后再被蒸馏,回流条件下,蒸馏瓶中某一组分的蒸气相与液相达到平衡,蒸馏的每一理论塔板代表一个汽液平衡。为了使复杂混合物获得较好的分离和纯化,常常需要较多的理论塔板数。在常规蒸馏中,分离程度取决于液相混合物中各组分的物理特性、使用蒸馏器的类型和结构、蒸馏方法等,可以将分馏、水蒸气蒸馏、真空蒸馏、抽提蒸馏与液-液萃取或者升华等技术联用,以提高分离效率。

(一)常压蒸馏

常压蒸馏装置(图4-16)主要由带有侧管的蒸馏烧瓶、温度计、冷凝器、收集器和加热装置等组成,温度计的水银球应低于蒸馏烧瓶的侧管出口3~5mm。在选择加热装置时应考虑被蒸馏液体的沸点:沸点在80℃以下时,用热水浴加热;沸点在80℃~200℃时,在石棉网上用直火或者用油浴加热;沸点在200℃以上时,用金属浴加热。蒸馏沸点在150℃以上的液体时,可使用空气冷凝器。为了防止发生过热而突然沸腾,在液体装入烧瓶后和加热之前,必须在烧瓶内加入沸石。在常压蒸馏中,具有多孔、不易碎、与蒸馏物质不发生化学反应的物质,均可用作沸石。沸石只能使用一次,当液体冷却之后,原来加入的沸石即失去效果,所以继续蒸馏时,须加入新的沸石。当添加新的沸石时,必须等烧瓶内的液体冷却到室温从后才可加入,否则有发生急剧沸腾的危险。常用的沸石是切成1~2mm 的素烧陶土。

                       

(二)减压蒸馏

对于高沸点和热灵敏的化合物,采用常压蒸馏易造成化合物分解,必须在0.13~26.7kPa条件下进行减压蒸馏。减压蒸馏装置(图4-16)由蒸馏烧瓶、蒸馏头、冷凝管、收集器、减压装置等部分组成,瓶塞的材料选择应考虑蒸气是否会造成侵蚀。装置安装完毕后,必须进行密封性能检验。

在减压蒸馏时,可在蒸馏烧瓶内插入毛细管,以防止暴沸现象的发生。检查并确定蒸馏装置密闭不漏气后,将蒸馏物质加入烧瓶中,加入量为烧瓶容量的一半,再将体系抽成减压状态,并开始加热。由于存在低沸点溶剂而产生泡沫,所以在开始蒸馏时应先保持低真空度条件,以便将这些低沸点溶剂蒸馏除去,然后再缓慢提高真空度。当蒸馏成分被蒸馏完毕或蒸馏过程需要中断时,应当先停止加热,待冷却后,再让空气缓缓进入装置内以恢复系统常压。

抽气减压装置通常用水泵或油泵,水泵能够达到的最低压力为当时温度下的水蒸气压。油泵的效能取决于油泵的机械结构以及油的质量,系统的压力常常控制在0.67~1.3kPa,如果存在挥发性有机溶剂、水或酸的蒸气,都会损坏油泵,必须在泵与装置之间安装冷却阱和干燥系统。

(三)分子蒸馏

分子蒸馏是一种特殊的液-液分离技术,它不同于传统蒸馏依靠沸点差分离原理,而是靠物质分子运动平均自由程的差别来实现分离。当液体混合物沿加热板流动并被加热时,低分子量分子和高分子量分子都会逸出液面而进入气相,由于不同物质的分子从液面逸出后移动距离(自由程)不同,当蒸发空间的压力很低(10-2~10-4mmHg),冷凝表面与蒸发表面间的垂直距离小于气体分子的平均自由程时,从蒸发表面汽化的蒸气分子,可以不与其他分子碰撞,直接到达冷凝表面而冷凝,低分子量分子达到冷凝表面被冷凝排出,而高分子量分子达不到冷凝表面,沿混合液排出,从而实现了物质的分离。

由于分子蒸馏操作温度低(远低于沸点)、真空度高(空载≤1Pa)、受热时间短(以秒计)、分离效率高等特点,特别适宜于高沸点、热敏性、易氧化物质的分离,同时可很好地保护被分离物质不被污染。

(四)水蒸气蒸馏

水蒸气蒸馏是使水蒸气连续地流过容器中的检材来进行蒸馏的技术,也是一种用于对热不稳定检材进行处理和纯化的技术,是分离和纯化检材中存在大量树脂状杂质有机物常用的方法。

被处理的检材组成应当具备以下条件:不溶或者几乎不溶于水、在沸腾期间与水长时间共存不会发生化学变化,在100℃左右条件下必须具有大于1.3kPa的蒸汽压。

常用的水蒸气蒸馏的简单装置如图4-17所示。水蒸气发生器盛水量为容器容积的75%为宜,如果太满,沸腾时水将冲至烧瓶。安全玻管须插到发生器的底部,当容器内气压增大时,水可以沿着玻管上升,以调节内压。如果系统发生堵塞,水便会从安全管的上口喷出,此时应当检查圆底烧瓶内水蒸汽导入管下口是否已被堵塞。


为了防止长颈圆底烧瓶中液体冲入冷凝管内,须将烧瓶的位置向发生器的方向倾斜45°。瓶内液体检材不宜超过其容积的1/3。蒸汽导入管的末端应弯曲,使它垂直地正对瓶底中央并且伸到接近瓶底。在水蒸气发生器与长颈圆底烧瓶之间应装上一个T 形管,在T 形管下端连一个弹簧夹,以便及时除去冷凝下来的水滴。

在蒸馏需要中断或者蒸馏完毕时,一定要先打开弹簧夹向烧瓶中通入空气,然后再停止加热,否则烧瓶中的液体将会倒吸到蒸汽发生器中。在蒸馏过程中,如果发现安全管中的水位迅速升高,则表示系统中发生了堵塞,此时应当立刻打开弹簧夹,然后再移去热源,待排除堵塞后再继续进行水蒸气蒸馏。

(五)实验室自动化蒸馏仪

近年来,生产厂家已经对玻璃器皿结构、接口边缘、柱子尺寸、加热罩、沸腾滴定容器、冷凝器等做了改进,使自动化蒸馏仪的性能和重复性得到改善,整个蒸馏单元可使用聚四氟乙烯制成,可以蒸馏高腐蚀性液体检材,无需担心溢出污染或者损害容器。

旋转带蒸馏系统(图4-18)是用来分离沸点非常相近的液体物质,可以制备、纯化和分离毫升量级的检材,可用于常压或减压蒸馏,此系统最大理论塔板数可以达到200,可用于分馏复杂的检材。微蒸馏方法与常规蒸馏方法相比具有蒸馏时间短、能够制备多种检材、可进行小体积检材蒸馏(常规的2%量)的优点。

 

五、消解

对于含有金属元素的化合物或检材,在对金属成分进行分析之前,可采用不同的方法进行金属成分的分离。对于比较简单的水溶性的无机金属化合物或离子,可采用水作为溶剂溶解进行分离。该过程不改变金属的存在形式,有利于了解金属的化学状态;而对于复杂基质中的金属待测物,尤其是生物检材中的金属毒物,因大部分与体内蛋白质结合成难解离的金属蛋白化合物,难以直接进行检验。因此,必须进行有机质的破坏,使金属毒物游离出来。

利用高温加热和氧化剂氧化,使与蛋白质结合的金属毒物解离变成无机化合状态的过程称消解,也称“有机质破坏”。分为传统消解和微波消解。

(一)传统消解方法

传统消解方法是利用高温加热和氧化剂氧化,使与蛋白质结合的金属毒物解离变成无机化合状态,分为干法和湿法两种。

1.湿法消解。湿法消化是通过氧化性酸或其他氧化剂,在解热条件下破坏有机质。使其生成二氧化碳、水和氮的氧化物等,并以气体形式挥发。

目前应用较普遍的方法是以硫酸与硝酸为试剂在凯氏烧瓶中消解的方法,该法消化较完全,但对有些金属毒物损失较大,且操作复杂,时间长,对环境污染大。所以,也有采用在密闭聚四氟乙烯罐中加硝酸、过氧化氢等氧化剂,与烘箱中消解或与微波炉中消解的方法,这类方法操作简单,无污染,损失小,但消化不够彻底。

2.干法消化。干法消化是将检材蒸干后在较高的温度下使有机物碳化,最后灼热灰化的方法,也可在检材中混加适当试剂促进有机质的分解避免金属毒物的损失。在这一过程中,金属毒物以碳酸盐或氧化物的形式存在于灰分中。

干法消化所用试剂量较少,最后产物便于处理。但温度较高,不适用于挥发性毒物的消化,如含汞化合物,也不适用于较大量的检材。

(二)微波消解

微波是波长在1mm到1m之间的电磁波。它具有对陶瓷、玻璃和塑料的穿透性,被金属的反射性和被水、含水或脂肪等物质的吸收性。对能吸收微波的物质,微波具有非常有效的瞬时深层加热作用,在较短的时间内达到较高的温度。与传统的传导加热方式相反,微波是对物质内部直接加热。这是由于吸收微波的极性分子在 2450MHz 的高频磁场中快速转向和定向排列,从而产生振动和分子之间相互的高速摩擦,迅速产生很高的热能。另外,由于被加热物质在微波的高频磁场中不断搅动,使其表面不断被破坏而产生新的表面,增强了扩散,使溶剂和试样能够充分作用,大大加速了试样分解作用的进行。

微波消解通常是指利用微波加热密闭容器中的各种酸、碱以及盐类的消解液与试样的混合液,在高温高压条件下使各种检材快速溶解的湿法消化过程。可用于工业,农业,环保,卫生检验,冶金,地质,医药,化工等部门各种试样的消解;特别适用于用原子光谱如AAS、ICP-AES、ICP-MS、原子荧光仪、以及阳极溶出仪等对各种试样中的微量、痕量及超痕量元素的准确测定。

微波消解方法一般可分为两类:敞口微波消解(常压微波消解)和密闭微波消解(高压微波消解)。

1.常压微波消解。常压微波消解一般用于一些易消解样品,并不需要很高的温度。但这种消解方法常造成易挥发元素的损失。同时,消解过程中挥发出的酸蒸气对仪器造成较大损害。此外,敞口消解不可避免地存在样品被玷污的可能。

2.高压微波消解。高压微波消解在消解罐中进行,因此又称密闭微波消解。它有以下几个优点:①所需酸用量小,一般不超过10 mL;②消解速度快,消解过程一般只需几分钟或十几分钟;③能防止消解过程中引入污染和易挥发元素的损失,提高测定的准确性;④容易实现自动化控制;⑤消解过程中不会对仪器造成损害。在密闭微波消解中应注意的两个问题是: ①避免酸与消解罐间的相互作用,应根据样品消解的不同要求选择合适的酸; ②消解样品的量不能太大,一般有机样品不能超过0.5 g,无机样品不能超过10 g。密闭容器反应和微波加热这两个特点,决定了其完全、快速、低空白的优点,但不可避免地带来了高压、消化检材量少的缺点。高压(最高可达100~150bar)、高温(通常180~240℃)、强酸蒸气给实验者带来了安全方面的心理压力。

微波消解通常使用硝酸、盐酸、氢氟酸、硫酸和双氧水等,硅铝合金类检材常使用氢氧化钾或氢氧化钠溶液消化处理。

   与传统消解方法比较,微波消解法具有许多优点:一是样品消化速度快,操作方便;二是由于微波穿透能力强,加热均匀,消化效率高,因而微波消解中样品分解完全;三是微波消化采用密封装置,减少了样品的损失和污染,不仅提高了分析的灵敏度和准确度,还可节约试剂,减少环境污染;四是微波消化系统有利于分析过程的自动化。

六、衍生化技术

衍生化技术是通过化学反应将检材中难于分析检测的待测物定量的转化成另一种易于分析检测的化合物,通过后者的分析检测可以对待测物进行定性和(或)定量分析,该技术在色谱分析中得到广泛应用。

(一)衍生化的作用

1.增加待测物的挥发性。某些高沸点、不汽化或热不稳定的化合物不能用气相色谱分析,通过衍生化转化成可以汽化的或热稳定的衍生物,适合用气相色谱分析。

2.提高检测的灵敏度(降低检测限)。液相色谱的紫外检测器灵敏度很高,但很多化合物没有紫外吸收或紫外吸收很弱,可以通过衍生化反应给这些化合物接上一个有强紫外吸收的基团;气相色谱的电子捕获检测器(ECD)对含卤素的化合物有很高的灵敏度,可以通过衍生化反应将一些化合物接上卤素基团,提高检出这些化合物的灵敏度。

3.改变化合物的色谱性能,改善分离度。一些异构体很难通过色谱法分离,通过衍生化反应,使两个异构体衍生物的色谱性能产生较大差异而得到分离。对一些难分离的物质可以选用某种衍生化试剂,只使其中一个发生衍生化反应转化成衍生物,两者可得到分离。具有R(-)与S(+)构型的光学异构体,其毒性和药动学特性不同,因此,对映异构体的分离十分重要。光学异构体的分离方法之一,就是采用不对称试剂,使其生成非对映异构体衍生物,然后用GC法或HPLC法进行分析测定。

4.帮助结构鉴定。利用衍生化反应可以帮助化合物结构的鉴定,这在使用色谱-质谱,色谱-红外光谱和色谱-核磁共振波谱联用方法确定化合物结构时作用更加明显。

(二)衍生化反应要求

1.反应定量重复。用于分析的衍生化反应应能迅速、定量的进行,反应重复性好,反应条件不苛刻,容易操作。

2.反应选择性好。衍生化反应的选择性高,最好只与待测物反应,即反应要有专一性。

3.产物能够分离。衍生化反应产物只有一种,反应的副产物和过量的衍生化试剂应不干扰待测物的分离与检测。

4.衍生化试剂易得。用于衍生化反应的试剂应方便易得,通用性好,且绿色环保。

(三)气相色谱中的衍生化

气相色谱中柱前衍生化主要是改善待测物的挥发性,衍生化可使待测物分子中含有活泼H的极性基团,如-COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等变成无极性的、易于挥发的待测物,从而可以降低GC的进样和气化温度,达到GC的分析要求。GC主要的衍生化反应有烷基化(alkylation)、酰化(acrylation)、硅烷化(silylation)等。1.硅烷化。硅烷化衍生化方法是气相色谱检材处理中应用最多的方法,它是利用醇、酚、羧酸、胺、硫醇等质子性化合物与硅烷化试剂反应,形成挥发性的硅烷衍生物,硅烷化反应一般在数分钟内即可完成。能进行硅烷化的化合物反应活性一般为:醇>酚>羧酸>胺>酰胺,反应活性还受空间位阻的影响,醇的反应活性为伯醇>仲醇>叔醇,胺的反应活性为伯胺>仲胺,一般反应式为:


常用的硅烷化试剂有三甲基氯硅烷、双-三甲基硅烷乙酰胺)、双-三甲基硅烷三氟乙酰胺、三甲基硅烷咪唑等。

2.酰化。酰化反应是用酰基取代有机化合物羟基、氨基、巯基中氢的反应,生成对应的酯和酰胺。酰化产物能降低含羟基、氨基、巯基化合物的极性,改善这些化合物的色谱性能(减少峰的拖尾),并能提高这些化合物的挥发性,也能增加某些易氧化化合物的稳定性。当引入含有卤离子的酰基时,还可提高使用电子捕获检测器(ECD)的灵敏度,常用的酰化方法有乙酰化法、多氟酰化法等。

(1)酸酐法。标准的乙酰化法是将检材溶于氯仿中,与乙酸酐和乙酸在5℃反应2~6h,真空除去剩余试剂。还可以乙酸钠、吡啶、三乙胺、甲基咪唑等碱性催化剂,与乙酸酐进行乙酰化反应,乙酰化反应通常在非水介质中进行,但胺类和酚类化合物乙酰化时可在水溶液中进行。

   三氟乙酸常用作衍生化反应的催化剂和溶剂。以三氟乙酸作催化剂的反应有烷基化、酰基化、酯化、硝化、烯烃的聚合、贝克曼酰胺重排等。将三氟乙酐加至弱的含氧酸中,离解出具有强酰化能力的酰基阳离子,易与醇发生酯化反应,活性较低的羟基化合物则需要微热才能使反应完全。采用这一酯化技术的羟基化合物有伯醇、仲醇、叔醇、多元醇,苯酚和苯硫酚等,此法特别适于空间位阻较大的醇、酚的酯化。

(2)多氟酰化法。常用的多氟酰化试剂有三氟乙酰(TFA)、五氟丙酰(PFP)和七氟丁酰(HFB)酐,反应活性是TFA>PFP>HFB。TFA和PFP的衍生物挥发性较强,而HFP的衍生物ECD灵敏度高。多氟酰化反应时间既取决于多氟酰化试剂的活性,又取决于待测物的活性。如麻黄碱和伪麻黄碱及其同系物与三氟乙酸酐(TFAA)在60℃时5min可完成反应;三环类抗抑郁待测物与七氟乙酸酐(HFBA)在60℃时10min 可完成反应;而哌可酸,脯氨酸,谷氨酸,γ~氨基丁酸的甲酯与HFBA的反应需在120℃时20min 完成。多数情况氟酰化反应不需溶剂,但胺和酸的多氟酰化常以苯为溶剂,三乙胺为催化剂。

3.烷基化。烷基化反应是用烷基取代有机化合物中活泼氢的反应。如有机酸由于强酸性和极性而导致其在色谱柱上被严重吸附,产生严重的拖尾而无法分析。而且大多数有机酸挥发性差,热稳定性也较低。因此,许多有机酸(特别是长碳链的有机酸)在进行气相色谱分析之前一般进行烷基化使其转变为相应的酯;含羟基的有机化合物则转变为相应的醚。常用的烷基化试剂有碘甲烷、叠氮甲烷、醇类、二甲基硫酸酯等。

(1)甲醇法。有机酸与甲醇在催化剂的存在下加热,可以发生酯化反应,生成有机酸的甲酯。当使用H2SO4作催化剂时,需要回流反应较长时间;若用三氟化硼作催化剂,反应可在室温下完成,通常是将三氟化硼通入甲醇中配制成酯化剂,然后再进行酯化反应。


(2)重氮甲烷法。重氮甲烷可与有机酸反应,生成有机酸的甲酯,放出氮气。此方法简便有效,反应速度快,转化率高,很少有副反应,不引入杂质,但反应要在非水介质中进行。反应条件虽温和,但重氮甲烷不稳定,有爆炸性和毒性(致癌),制备和使用时要特别小心。常温下酚羟基可与重氮甲烷缓慢反应,但在0℃以下时可避免酚羟基反应。


(3)其他酯化方法。为了提高方法的灵敏度和选择性,有时需要制备甲酯以外的酯,这些酯化方法有的类似于甲酯化反应,如以重氮乙烷、重氮丙烷、重氮甲苯代替重氮甲烷,可制得相应的酯。而且这些试剂稳定性好、爆炸性小。用BF3的丙醇、丁醇或戊醇溶液与有机酸反应,也可制备相应的丙酯、丁酯或戊酯。

 4.卤化。在待测物中引入卤原子后可使用ECD检测器,提高检测的灵敏度(降低检测限),同时也可改善挥发性和稳定性,常用的卤化衍生化方法有:

(1)卤素法。用卤素直接作为衍生化试剂处理检材,卤素的反应是加成或取代。

 

(2)卤化氢法。常用HCl和HBr为衍生化试剂与不饱和链发生加成反应或与羟基发生置换反应。


(3)N -溴代丁二酰亚胺(NBS 法) 。NBS是选择性很强的卤化衍生试剂,可使烯丙位的氢原子发生溴代反应。

                 

(四)液相色谱中的衍生化

对于在紫外、可见光区没有吸收或者摩尔吸收系数小的待测物,可以使其衍生成对可见-紫外检测器、荧光检测器及电化学检测器等具有高灵敏度的衍生物,提高待测物的检测灵敏度,改善检测能力。

液相色谱中荧光检测器的灵敏度要比紫外检测器高出几个数量级,但是液相色谱能分离的对象,多数没有荧光,主要依靠荧光衍生化试剂通过衍生化反应在待测物上接上能发出荧光的生色基团,达到荧光检测的目的。由于荧光衍生物的激发波长和发射波长与荧光衍生试剂本身不同,即使有过量的试剂或有反应副产物存在,也不会干扰荧光衍生物的检测,因此荧光衍生化反应不需要纯化衍生物,可以直接进样。

液相色谱中的电化学检测器灵敏度高、选择性强,为待测物的检测提供了新的途径,但由于电化学检测器只能检测具有电化学活性的化合物,如果待测物没有电化学活性就不能被检测。此时,可将带有硝基的衍生化试剂与羟基、氨基、羧基和羰基化合物反应,生成电化学活性的衍生物。

液相色谱中按衍生化反应发生在色谱分离之前还是之后进行,可将衍生化分为柱前衍生化和柱后衍生化。由于柱前衍生化法是在分离前使待测物与衍生化试剂反应,故与待测物具有相同官能团的杂质也会同样被衍生化,这样就可能降低衍生反应效率,妨碍待测物的检测,应尽可能将待测物进行精制后再衍生化。柱后衍生化是在待测物经色谱柱分离之后进行的,提高了选择性。

1.适应紫外检测器的衍生化反应

(1)苯甲酰化反应。苯甲酰氯、对硝基苯甲酰氯、3,5-二硝基苯甲酰氯和对甲氧基苯甲酰氯都可以同胺、醇和酚类化合物反应,生成强紫外吸收的苯甲酸酯类衍生物,反应如下:

      

过量试剂可以通过水解除去,反应产物可用有机溶剂提取后直接进样。

(2)2,4 -二硝基氟代苯(DNFB)的反应。DNFB与醇的反应产率很低,但可与大多数伯胺、仲胺和氨基酸反应,生成强紫外吸收的苯胺类衍生物。


(3)苯基异硫氰酸酯(PTIC)的反应。PTIC可与氨基酸反应,生成苯基己内酰硫脲氨基酸衍生物。


   苯基异氰酸酯与醇类反应生成苯基甲酸酯

        

(4)苯基磺酰氯的反应。苯基磺酰氯可与伯胺和仲胺反应。

         

甲苯磺酰氯可与多氨基化合物反应,不仅能提高它们的检测灵敏度,还可改变HPLC的分离度。

(5)有机酸的酯化反应。有机酸很容易与酰溴基反应生成酯,常用的酰溴基试剂有苯甲酰溴、萘甲酰溴、甲氧基苯甲酰溴、对溴基苯甲酰溴和对硝基苯甲酰溴等。酯化反应应在极性溶剂(如乙腈,丙酮或四氢呋喃)中进行,有时需加三乙胺或N-二异丙基胺等催化剂。


(6)羰基化合物的反应。醛类和酮类中的羰基可与2,4-二硝基苯肼(DNPA)反应,生成苯腙衍生物,反应在弱酸性条件下进行:

 羰基化合物还可以与对硝基苄基羟胺(PNBA)反应,生成有强紫外吸收的肟,反应需碱催化。


(五)衍生化反应所需设备及注意事项

1.衍生化反应试剂瓶。色谱检材前处理所用的衍生化反应处理的检材往往都是很少量的,一般都是在毫克(mg)或毫升(mL)量级,所以使用的设备都是进行微量有机合成的一些小型装置,其衍生化方法也都遵循进行微量有机合成反应的原则。根据涉及的反应类型不同,可以在各种反应试管和容器中或在密闭的安瓿瓶(图4-19)中进行这些衍生化反应。


 

对于处理体积极小,只有几微升到几十微升的反应混合物时,应采用锥形底反应管瓶,便于反应后抽取衍生产物进行色谱分析。

衍生化反应完成后脱除挥发性溶剂(包括过剩的可挥发性衍生化试剂)最方便的方法之一是用干氮气流吹洗,可以用一个接氮气源的针头处理检材。

2.衍生化反应过程注意的问题

(1)避免水的干扰。在使用一些对水“敏感”的衍生化试剂时一定要对检材和使用的溶剂进行脱水,并在反应过程中避免水汽的干扰;

   (2)防止衍生化产物挥发。当生成的衍生物产物是易挥发化合物时应采用密封的衍生化容器或低温冷冻处理防止待测物的流失;

(3)及时分析。衍生化反应完成后应及时进行色谱分析,如不能及时分析,要将衍生化产物妥善存放,并尽快进行分析。

第三节其他前处理技术

随着色谱、光谱分析技术的发展,为了适应仪器检测的要求,样品前处理技术也得到了迅速的发展。通过各学科前沿知识相互交叉,衍生出许多新型萃取技术,如超临界流体萃取、微波萃取、加速溶剂萃取、凝胶渗透色谱净化、微透析技术等。这些技术具有溶剂用量少、样品处理量少、提取效率高、易于自动化、可与其他技术联用等特点。而且通过去除或减少干扰物质或富集被测组分,可提高检测的灵敏度和选择性。

一、超临界流体萃取

超临界流体萃取(supercritical fluid extraction,SFE)是用超临界流体作为萃取剂,从组分复杂的检材中,将待测组分分离提取出来的一种分离提取技术。

(一)超临界流体

如图4-20所示,每种物质都有一个特定的温度,在这个温度以上,无论怎样增大压强,气态物质都不会液化,这个温度就是临界温度(Tc)。临界温度是使物质由气态变为液态的最高温度。临界压力(Pc)是在临界温度时使气体液化所需要的最小压力,也是液体在临界温度时的饱和蒸气压。临界温度和临界压力下的状态称为临界状态。高于临界温度和临界压力下,物质不会成为液体或气体,这一点就是临界点。在临界点以上的范围内,物质状态处于气体和液体之间,这个范围之内的流体成为超临界流体(SF)。利用超临界流体的强溶解能力特性对物质进行溶解和分离的过程称为超临界流体萃取。

超临界流体的密度和液体相近,大致是气体的100~1000 倍,因此超临界流体的分子间作用力比气体强,它与溶质分子的作用力也很强,与液体一样,很容易溶解其他物质;粘度与气体相近,但扩散系数约比液体大100倍,传质速率很高,这也有利于物质在超临界流体中的溶解,因此,超临界流体具有类似气体的较强穿透力和类似于液体的较大密度和溶解度,是介于气体和液体之间的一种非气态,又非液态的物质,具有气体和液体的双重特性。超临界流体的表面张力很小,很容易穿进检材基质内,并能保持较高的流速,这些特性使得超临界流体成为一种十分理想的萃取剂,可使萃取过程在高效、快速的条件下完成。

可作为超临界流体的物质很多,如二氧化碳、一氧化亚氮、六氟化硫、乙烷、庚烷、氨等,低烃类物质因易燃易爆不常使用,超临界流体萃取中多选用临界温度接近室温的CO2(Tc=31.1℃,Pc=7.38MPa)。对于极性较大的化合物也可用氨或氧化亚氮作为超临界流体进行萃取,因为它们具有一定极性,对极性化合物溶解性能好,但氨容易与其他物质反应,对设备腐蚀严重;而氧化亚氮有毒,具有强氧化性。

(二)超临界流体萃取操作方式

超临界流体萃取大致可分为三步:首先待测物从检材基体中释放出来,并扩散、溶解到超临界流体中;然后将待测物从萃取器转移至收集系统;第三步是降低超临界流体压力,有效地收集被萃取的待测物。

根据超临界流体与检材的作用方式可将超临界萃取的操作方式分为动态、静态、循环萃取三种。

1.动态法。动态法是超临界流体萃取剂直接通过检材萃取管,使被萃取组分直接从检材中分离出来,进入吸收管。它简单、方便、快速,特别适用于萃取那些在超临界流体萃取剂中溶解度很大,而且检材的基体又很容易被超临界流体萃取剂渗透的检材。

2.静态法。静态法是将被萃取的检材浸泡在超临界流体萃取剂中,经过一定的时间后再把含有被萃取溶质的萃取剂流体输入吸收管。它没有动态法那么快速,但适用于萃取那些与检材基体较难分离或在萃取剂中溶解度不大的物质。也适用于检材基体较为致密,超临界流体萃取剂不易渗透的检材。

3. 循环法。循环法是将超临界流体萃取剂先充满装有检材的萃取管,然后用循环泵使萃取管内的流体反复、多次通过管内萃取检材,最后输入吸收管。



(三)CO2超临界流体萃取

 1. CO2作为超临界流体萃取剂特点。(1)可以在接近室温(35~40℃)条件下进行提取,能够有效地防止热敏性物质的氧化,对有效成分破坏少,特别适合于处理高沸点热敏性物质;(2)CO2是一种容易制取的高纯度不活泼气体,萃取过程中不发生化学反应,能够避免产品的氧化;(3)CO2可看作是与水相似的无毒、廉价的有机溶剂,无有害溶剂的残留,从而防止了提取过程中对操作人员伤害和对环境的污染;(4)在超临界CO2萃取时,被萃取的物质通过降低压力,或升高温度即可析出,萃取和分离合二为一。

2.超临界流体萃取夹带剂。CO2极性很低,在超临界状态下,对低分子、低极性、亲脂性、低沸点的挥发油、烃、酯、内酯、醚、环氧化合物等表现出优异的溶解性,但含有极性基团(-OH,-COOH等)的亲水性多元醇、多元酸及多羟基芳香族化合物均难溶于超临界CO2中;对于高分子量化合物,分子量越高,越难萃取,分子量超过500的高分子化合物几乎不溶于超临界CO2中。这就需要向由检材和超临界CO2组成的二元体系中加入第三组分,称为夹带剂(也称亚临界组分),来改变待测物的溶解性能。常用的夹带剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯。有时也采用衍生化方法来增加待测物在CO2中的溶解能力。

夹带剂可以从CO2的密度和溶质与夹带剂分子间的相互作用两个方面影响溶质在超临界CO2流体萃取中的溶解度和选择性,其中夹带剂与溶质分子间的范德华力、氢键作用是影响溶解度和选择性的决定因素。夹带剂在改善超临界CO2流体萃取的溶解性的同时,也会削弱萃取系统的捕获作用,导致共萃物的增加,还可能会干扰分析测定,所以夹带剂的用量要小,一般不要超过5%。由于使用了夹带剂,增加了从萃取物中分离回收夹带剂的难度,使得一些萃取物中有夹带剂的残留。

(四)影响超临界流体萃取的因素

   1.萃取压力。萃取温度一定时,压力增大,流体密度增大,溶剂强度增强,溶剂的溶解能力就增大。对于不同的物质,其萃取压力有很大的不同。当超临界流体的温度略高于临界温度时,超临界流体的压缩系数最大,此时压力的微小变化,就能导致其密度的变化,调节压力可以控制其密度,因而可以控制其对溶质的溶解能力。这样,在稍高于临界温度的情况下,改变超临界流体的压力,就可以把检材中的不同组分按它们在超临界流体中的溶解度大小不同而先后萃取出来。在低压下溶解度大的组分先萃取,随着压力增加,难溶组分逐渐与基体分离而被萃取。所以利用程序升压,超临界流体不但可以从复杂检材中萃取各种组分,而且也可以使这些组分得到初步的分离。

   2.萃取温度。温度对超临界流体溶解能力影响比较复杂,在一定压力下,升高温度,被萃取物挥发性增加,这样就增加了被萃取物在超临界气相中的浓度,从而使萃取量增大;但另一方面,温度升高,超临界流体密度降低,从而使化学组分溶解度减小,导致萃取量减少。因此,选择萃取温度时要综合考虑这两个因素。在低温区(仍在临界温度之上),温度升高,超临界流体密度下降,减少了检材在流体中的溶解度,而此时被萃取溶质的蒸气压升高并不多,这将导致萃取能力降低。当温度进一步升高,进入高温区时,虽然温度升高,流体的密度仍在降低,但此时被萃取的溶质的蒸气压迅速升高,挥发度提高,这时的萃取能力不会下降而有增加的趋势。

   3.萃取颗粒。粒度大小可影响提取回收率。减小检材粒度,可增加固体与溶剂的接触面积,从而使萃取速度提高。不过,粒度过小、过细,会严重堵塞筛孔,造成萃取器出口过滤网的堵塞。

   4.CO2流量。CO2流量的变化对超临界萃取有两个方面的影响。CO2的流量太大,会造成萃取器内CO2流速增加,CO2停留时间缩短,与被萃取物接触时间减少,不利于萃取率的提高。另一方面,CO2的流量增加,可增大萃取过程的传质推动力,相应地增大传质系数,使传质速率加快,从而提高SFE的萃取能力。因此合理选择CO2的流量在SFE中也相当重要。

   5.夹带剂。在超临界流体中加入甲醇、异丙醇、氯仿等极性溶剂,可使溶剂的活性改变,使超临界萃取技术的使用范围扩大到极性较大的化合物,而且萃取条件更低,萃取率更高。夹带剂的种类可根据萃取组分的性质来选择,加入的量一般不超过5%。 

超临界流体萃取技术还可以与色谱仪器实现在线联用,可避免检材转移的损失,减少了各种人为的误差,提高了方法的精密度和灵敏度,已有的联用技术有SFE-GC、SFE-SFC、SFE-HPLC和SFE-MS等。

二、微波萃取技术

在一般的液-固萃取中,为了提高萃取效率,加快萃取速度,人们常采用加热萃取溶剂的方法。但是萃取溶剂的沸点限制了萃取温度的提高,使得一般的液-固萃取时间较长,试剂用量也较大。随着微波技术的发展,微波萃取技术(micro amplitude extraction,MAE)被应用到液-固萃取技术中,用来制备色谱分析的样本,特别是从一些固态检材中萃取有机物。

微波萃取是利用极性分子可迅速吸收微波能量来加热乙醇、甲醇、丙酮或水等极性溶剂,使固体或半固体物质中的有机物成分与基体有效分离,并保持待测物原本状态的一种分离方法。是一种萃取速度快、试剂用量少、回收率高以及易于自动控制的检材处理技术,可用于色谱分析的样本制备。因为非极性溶剂不能吸收微波能量,所以在微波萃取中不能使用100%的非极性溶剂作为萃取溶剂,可在非极性溶剂中加入一定比例的极性溶剂,如丙酮-环己烷(体积比1:1)作为微波萃取溶剂。

(一)微波萃取过程与原理

在传统的萃取过程中,能量首先无规则地传递给萃取剂,然后萃取剂扩散进入基体物质,再从基体中溶解或夹带多种成分扩散出来,即遵循加热-渗透进基体-溶解或夹带-渗透出来的模式,萃取的选择性只能通过改变溶剂的性质或延长溶剂萃取时间来获得,由于同时受溶解能力和扩散系数的限制,选择面很窄,而延长溶剂萃取时间则大大降低了萃取效率和速度。微波萃取法是利用不同物质的介电常数不同,其吸收微波能的程度不同,由此产生的热能及传递给周围环境的热能也不相同。在微波场中,吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热,从而使得被萃取物质从基体或体系中分离,进入到介电常数较小、微波吸收能力相对较差的萃取剂中。微波萃取能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热,具有较好的选择性。另一方面,由于微波萃取受溶剂亲和力的限制较小,可供选择的溶剂较多。

微波萃取是将检材放在聚四氟乙烯材料制成的检材杯中,加入萃取溶剂后将检材杯放入密封好、耐高压又不吸收微波能量的萃取罐中。由于萃取罐是密封的,当加热萃取溶剂时,萃取溶剂挥发使罐内压力增加。压力的增加使得萃取溶剂的沸点也大大增加。这样就提高了萃取温度。同时,由于密封,萃取溶剂不会损失,减少了萃取溶剂的用量。

(二)微波萃取特点

微波具有波动性、高频性、热特性和非热特性四大特点,决定了微波萃取具有以下特点:

1.试剂用量少,易于控制。微波萃取受溶剂亲和力的限制较小,可供选择的溶剂较多,在微波萃取过程中,溶剂对微波能的吸收成为决定性因素,而溶质本身的极性是次要的。一般选择极性溶剂,所遵循的原则与传统溶剂萃取法相似,要求溶剂与目标成分有相似的极性,与传统萃取法不同的是溶剂用量可以比传统方法减少 30%~60%。溶剂用量大反而不利于提取,因为微波在穿透溶剂过程中会发生衰减,溶剂越多,使得到达基体物质的微波能减少,反而影响萃取效果。由于非极性物质不吸收微波能,如果使用非极性溶剂时一定要加入一定比例的极性溶剂。操作过程中控制微波功率可实现立即加热和终止,而应用人机界面和可编程逻辑控制器可实现工艺过程的自动化控制。

2.加热均匀,选择性好。传统热萃取是以热传导、热辐射等方式自外向内传递热量,而微波萃取是一种“体加热”过程,即内外同时加热,因而加热均匀,热效率较高。微波萃取时没有高温热源,因而可消除温度梯度,且加热速度快,物料的受热时间短,因而有利于热敏性物质的萃取。微波只对极性分子进行选择性加热,整个萃取过程由微波辐射能穿透介质,到达物料的内部,使基质内部温度迅速上升,增大了萃取成分在介质中的溶解度。微波产生的电磁场加速了目标物向溶剂的扩散。微波对检材中的不同组分进行选择性加热,可使目标组分与基体直接分离开来,可提高萃取效率和产品纯度。

 3.工艺简化,回收率高。介质吸收微波的能力主要取决于其介电常数、介质损失因子、比热和形状等。利用不同物质介电性质的差异也可以达到选择性萃取的目的。水是吸收微波最好的介质,任何含水的非金属物质或各种生物体都能吸收微波。因为水分能有效吸收微波能产生温度差,微波萃取的结果不受物质含水量的影响,所以待处理物料中含有水分无需干燥预处理,简化了处理过程。对于不含水分的物料,要采取润湿的方法,使其具有适宜的水分。

(三)微波萃取的影响因素

)波萃取的结果不受物质含水量的影响,特性四大特点,这剂加热时,由1.萃取温度。用微波萃取可以达到常压下使用同样溶剂所达不到的萃取温度,但温度过高有可能使待萃取的化合物分解。所以要根据待萃取化合物的热稳定性来选择适宜的萃取温度,达到既可以提高萃取效率,又不至于分解待萃取化合物的目的,一般不高于溶剂沸点。

2.萃取溶剂。由于微波加热时只有极性物质能吸收微波能量而升高温度,非极性物质不能吸收微波能量,故不能升高温度。所以使用非极性溶剂时一定要加入一定比例的极性溶剂。溶剂的混合比例不同,萃取效率也有所不同。通常是以“相似相溶”方式进行选择。

3.萃取时间。微波萃取时间与被测样品含量、溶剂体积和加热功率有关。一般情况下,萃取时间在 10~15 min 内,不同的物质其最佳萃取时间不同。在萃取过程中,一般加热1~2 min 即可达到要求的萃取温度。累计辐射时间对提高萃取效率只是在刚开始时有利,经过一段时间后萃取效率不再增加,因此每次辐射时间不宜过长。

4.溶液的pH。组分中含有一种或多种官能团,如-OH、-CHO、-COOH、-NH2、-OSO3H等时,能够得到或者给出质子,使得各组分在不同pH条件下,表现出不同的溶解能力。因此,溶液的pH值会对微波萃取的效率产生一定的影响,针对不同的萃取检材,溶液有一个最佳的用于萃取的酸碱度。

5.容器材料。用有机材料作容器往往对被萃取的有机化合物产生吸附或污染,但用聚四氟乙烯制成的检材杯在用微波萃取时,无论是新检材杯,还是用过的检材杯,对回收率均没有明显的影响。

三、加速溶剂萃取

加速溶剂萃取(accelerated solvent extraction,ASE)是利用高温(50℃~200℃)、高压(10.3~20.6MPa)条件下但未及临界点的液体作萃取溶剂,对固体或半固体检材进行萃取的检材前处理方法。包括加压萃取(PLE)、高压溶剂萃取(PSE)、加压热溶剂萃取(PHSE)、高温高压溶剂萃取 (HPHTSE)和加压热水萃取(PHWE)等。

(一)加速溶剂萃取原理与特点

ASE 是在高压高温下进行提取,高温能极大地减弱由范德华力、氢键、溶质分子和检材基体活性位置的偶极吸引力所引起的溶质与基体之间的相互作用力,加速溶质分子的解析动力学过程,减小解析过程所需的活化能;降低了溶剂的粘度,使溶剂具有更强的穿透能力;同时降低了溶剂基质的表面强度,减小了溶剂进入检材基体的阻力,有利于溶剂在检材基体中的扩散;降低了溶剂和检材基体之间的表面张力,使被萃取物与溶剂能够更好的接触,增加了物质溶解度和溶质扩散效率,缩短了萃取时间和溶剂用量;简化了净化步骤。它已经被美国国家环保局批准为EPA3545号标准方法。

(二)加速溶剂萃取过程

加速溶剂萃取仪(ASE,图4-21)是美国戴安公司推出的全新检材前处理技术,主要由溶剂瓶(带有多元溶剂自动混合器)、泵、气路系统、加温炉、不锈钢萃取池和收集瓶组成,溶剂瓶有4个,可装入不同的溶剂,可选用不同溶剂先后萃取相同的检材,也可用同一溶剂萃取不同的检材,可以连续进行24次提取。工作时,选择一定体积的萃取池,在底端加纤维滤纸膜,将研磨好的检材装入萃取池中,检材通常与一定比例的硅藻土或无水 Na2SO4研磨混匀。装好的萃取池放在萃取池托架上,对应的下方放一收集瓶。启动仪器,萃取池被自动送入加热炉内,并向萃取池中加注溶剂到设定压力和加热到设定温度。检材处于高温、高压下(静态萃取)一定时间后,将萃取液注入到收集瓶中。达到静态萃取时间后,萃取池中的萃取液释放于收集瓶中;再向萃取池注入新溶剂,进行下一静态萃取循环,直到完成设定的循环次数。然后用一定体积的新溶剂冲洗萃取池,再用 N2将剩余的溶剂吹入收集瓶中,保证萃取液被全部收集。仪器自动将萃取池退出加热炉,并冲洗管路,进行下一萃取过程,检材处理的全过程仅需13~20min。

(三)加速溶剂萃取影响因素

1.温度。温度的增高能够破坏溶剂与基质之间的作用力(范德华力,氢键等等), 降低溶剂和检材基体之间的表面张力,使溶剂能更好地“浸润”检材基体,有利于被测物与溶剂的接触,使被溶物快速从基质中解析出来。温度的增高能降低溶剂的粘度,减小解析过程所需的活化能,因而加速了溶质分子的解析动力学过程,使溶剂具有更强的穿透能力,能更快速地萃取。

温度从25℃增至150℃,被溶物扩散系数大约增加2~10倍,使溶剂溶解待测物的容量增加。当温度从50℃升高至150℃后,蒽的溶解度提高了约13倍;烃类的溶解度,如正二十烷,可以增加数百倍。由于加速溶剂萃取在高温下进行,因此热降解是一个值得关注的问题。加速溶剂萃取的运行程序是先加入溶剂,即检材在溶剂包围之下再加温,而且在加温的同时加压,即使在高压下加热,高温的时间一般少于10min,因此,热降解不很明显。

   2. 压力。升高压力能够使溶液的沸点增高, 使溶剂在较高的温度下保持液态,例如丙酮在常压下的沸点为56.3℃,而在5个大气压下,其沸点高于100℃。液体对溶质的溶解能力远大于气体对溶质的溶解能力,因此,欲在提高的温度下仍保持溶剂为液态,可增加压力。压力可以使溶剂进入基质微孔,与基质更全面地接触。使用过程中,固体检材被密封于一个装满萃取溶剂的检材池中。在10.3~20.6MPa压力条件下只需要5~10min就可以完成检材萃取,然后由压缩气体将萃取的待测物从检材池吹入收集器。

3.溶剂。选择合适的溶剂是加速溶剂萃取技术的关键,除强酸、强碱以及燃点温度为40~200℃的溶剂(如二硫化碳、二乙醚和1,4-二氧杂环乙烷)之外,很多溶剂可用于加速溶剂萃取。萃取溶剂的极性一般应与待测物的极性相匹配,因此选择时通常应考虑其理化特性,如沸点、极性、比重和毒性等。使用极性比较强的溶剂(乙腈,甲醇,乙酸乙酯等)可用于湿检材的萃取,以水作溶剂用于湿检材的萃取是非常有效的。极性溶剂和非极性溶剂的混合物在某种情况下可提高提取率。

   4.分散剂与改进剂。检材在加入萃取池之前,应进行研磨和筛分,降低粒子尺寸,促进目标物质向溶剂中的扩散。为了确保溶剂和检材基质的良好接触,通常要求在预处理检材中添加惰性物质以避免检材粒子的聚合。EDTA-水洗砂子、碱式氧化铝、硫酸钠、石英砂和硅藻土已作为检材混合剂用于加速溶剂萃取。加入某些有机、无机改进剂和添加剂可改变溶剂在升温时的理化特性,以增强待测物在溶剂中的溶解性及其与溶剂间的作用。表面活性剂作为改进剂已用于从鱼组织中萃取多环芳烃。甲醇溶剂中加入环庚三烯酮酚改进剂可使丁基三氯化锡的提取率提高60%。丁基三氯化锡的提取率受2个对立因素的影响:一方面,丁基三氯化锡与环庚三烯酮酚络合生成低极性的分子,其在中等极性溶剂中具有低的溶解度,导致提取效率降低;另一方面,目标物分子因被屏蔽而阻碍了其与蛋白基质的结合,提高了提取效率。

   5.检材基质。基质的影响取决于检材的组成,不同检材在其理化特性、粒径等方面差异很大,影响目标物质的吸附和保持。使用同样的加速溶剂萃取条件,不同基质检材中同一目标物质的提取效率也存在较大差异。如在100℃,用庚烷从植物饲料、家禽饲料、鲭油和猪肉脂肪中萃取多氯联苯时,其平均回收率分别为110%,89%,81%和77%。

对于血液或尿液检材,直接和硅藻土混合后经加速溶剂萃取,提取液中含有的色素等杂质较多。而中性氧化铝具有吸附色素、蜡质、脂肪的作用,为了降低杂质的萃出,在萃取池底部放入一些氧化铝,可达到在线净化目的。

   6.萃取模式。根据萃取时萃取溶剂是否流动,加速溶剂萃取可采取静态和动态2种操作模式,静态萃取过程中,为了实现目标物质从检材中预期离析,提高提取率,可采取多次循环萃取。动态萃取模式可改善质量传输,但因较高的溶剂消耗而导致少有使用。使用静态模式,目标物质的萃取效率取决于分配平衡常数和化合物在升温条件下的溶解性。

另一影响因素是静态萃取时间,即一定温度压力下萃取过程持续的时间,静态萃取时间越长,萃取效率越高。多数检材一个循环就可以得到较高的回收率,对难提取的检材还可以通过增加静态萃取循环次数的方式提高萃取效率。ASE 采用冲洗和氮气吹扫技术保证了萃取溶剂全部回收到收集瓶中,减少了损失,保证了回收率。

(四)加速溶剂萃取的特点

加速溶剂萃取与索氏提取、超声、微波、超临界和经典的分液漏斗振摇等传统方法相比,突出优点是可进行固体半固体的萃取(检材含水质量分数为75%以下);有机溶剂用量少(1g检材仅需1.5mL溶剂),显著降低了单个检材的提取费用;萃取时间短(13~20min);同时可以选用四种溶剂萃取,萃取效率高;自动化程度高,只需将检材装入萃取池设定程序即可自动工作,多个传感器可以保证仪器安全操作;ASE萃取溶剂可以根据常规提取方法的溶剂选择原则获得,使用多元混合溶剂时,仪器自动混合,减少了对操作者的毒性;ASE萃取的整个操作处于密闭系统,减少了溶剂挥发对环境的污染。

由于加速溶剂萃取的选择性不足,多采用固相萃取、固相微萃取对萃取液进一步净化。特别是油脂检材,常通过凝胶渗透色谱分离净化。不同萃取方法的串接以及萃取与净化过程同在萃取池中完成是进一步降低基体干扰和改善选择性的有效途径。


四、凝胶渗透色谱净化技术

凝胶渗透色谱(Gel permeation chromatography,简称GPC)是利用高分子溶液通过填充有特种凝胶的柱子时,按其分子大小进行分离的方法。是有机检材前处理中非常有效的净化分离手段,已成为美国环保局(EPA),美国食品药物管理局(FDA),美国分析化学协会(AOAC)以及欧盟委员会(EN)法定的方法。

(一)凝胶渗透色谱技术原理

凝胶渗透色谱是液相色谱的一个分支,分子尺寸不同的多组分溶液通过凝胶时,可选择性地渗透进凝胶孔洞,其渗透能力与孔的尺寸和分子的尺寸有关。较小的分子能渗透到凝胶孔内,超过这个尺寸的大分子不能渗透进去,只能随溶剂的流动在凝胶粒子之间的空隙中流动。因此,就分子尺寸而言,分子越小,在孔内驻留的时间越长,而较大的分子在柱内驻留的时间短。因此较大的分子首先被洗脱分离出来,较小的分子受溶剂分子的排斥也随后逐级被洗脱分离出来,根据分子不同的行程可把多组分分子混合物逐级分离开。

凝胶渗透色谱与通常使用的液相色谱法不同,常规液相色谱法是利用固定相、检材混合物和流动相之间极性的差别而达到分离目的;凝胶渗透色谱则是利用检材中各组分分子大小不同而洗脱顺序有先后达到分离目的,洗脱溶剂的极性对分离的效果并不起决定作用,这对于净化含脂肪、色素较多的检材具有明显的优势。

凝胶渗透色谱可用于分离相对分子质量从400到107的分布情况;用于分离分析化学性质相同、分子体积不同的高分子同系物;分离、净化富含色素、蛋白质、生物碱、油脂等检材以及用于小分子物质的分离和鉴定。随着柱填料的改进和各种检测器的配合, 该方法成为从高分子量基体中分离出低分子量化合物的最有效手段,已广泛用在环境检测、农产品检测、食品检测、刑事化验以及生命科学等领域。

(二)凝胶渗透色谱净化条件的选择

1.色谱柱与凝胶。凝胶渗透色谱柱子为玻璃柱或金属柱, 为了使色谱柱能容纳一定量的杂质并使之与待测物分开,其内径和长度必须经过严格选择。内径一般在1.5~62.5px,柱内通常装填交联度很高的由含一个烯键的单体与一些含有二个烯键的交联剂交联聚合而成的有机高聚物凝胶,也有用无机多孔刚性的硅胶球或多孔玻璃,凝胶的高度不低于500px。

柱填料是GPC分离的关键因素,其结构直接影响仪器性能及分离效果。因此,要求柱填料具有良好的化学惰性、一定的机械强度、不易变形、流动阻力小、不吸附待测物、分离广等性质。柱填料可分为有机凝胶和无机凝胶。一般来说有机凝胶要求将凝胶用单一溶剂或混合溶剂浸泡适当时间(不少于六小时)后进行湿法装柱,柱中的凝胶应始终保持在溶剂中。如果需要更换柱中溶剂,同样必须先让新溶剂浸泡柱中凝胶,浸泡几小时之后方能正式使用。有机凝胶柱效较高,但其热稳定性、机械强度和化学惰性差,凝胶易于老化,对使用条件要求较高;无机凝胶除微粒凝胶外都能够用干法装柱,虽然柱效差一些,但在长期使用中性能稳定,对使用条件要求较低,且易于掌握。根据凝胶对溶剂的使用范围不同,还可以把凝胶分为亲水性凝胶、亲油性凝胶和两性凝胶。适用于有机溶剂体系的有聚苯乙烯凝胶、聚乙酸乙烯醋凝胶、聚甲基丙烯酸醋凝胶等。适用于水溶液、电解质溶液体系的有三维网格结构的葡聚糖及琼醋糖胶等。另外在一些有机高聚物上引入一些基团或使原有的基团改性可以调节或改变它的亲油性或亲水性,用于极性有机溶剂或水溶液体系。无机的多孔性物质,如硅胶、多孔玻璃珠等填料在水溶液体系和有机溶剂中都可以应用,而且机械强度高,耐热性能好,但容易造成极性拖尾和渗留。

GPC法的柱填料和被分离试样没有任何相互作用,完全靠分子自身的大小进行分离。这种按体积大小的分离方式决定了GPC技术可在温和条件下进行,因为没有可逆吸附,所以每个适用于GPC分离的检材都能完全洗脱。GPC柱性能可保持较长时间,可反复使用。

球形凝胶是一种表面惰性物质,具有三维网状结构,含有许多分布的大小不同的孔洞,凝胶间有一定的孔隙。孔径大小和分离的分子量范围有一简单的近似关系:

胶的孔径(Å)×40=排斥极限分子量

胶的孔径(Å)×20=适于分离分子量

一般可用这简单的关系来选用合适的胶。

被采用的凝胶必须至少符合两个条件:第一,可使用有机溶剂;第二,凝胶孔径较小。凝胶规格的选择主要是凝胶孔径,一般是根据待测物及待分离的杂质的分子量来决定。由于待分离物质的分子量较小,在实际应用中均优先采用孔径小的凝胶,当然凝胶规格的选择并不是越小越好,而是以其净化效率为依据。

由于实验中各种条件不尽相同,柱子在使用前进行标定是必要的。色谱柱的标定是确定分离物质的洗脱体积,在净化上则指确定杂质与待测物的洗脱体积。一根柱子只要保持挽胶、溶剂等条件不变,一般只需标定一次。

2.溶剂。凝胶渗透色谱中所选用的溶剂应该对待测物有良好的溶解度,并对凝胶有一定的溶胀能力。能使每克凝胶的溶胀体积超过2.5mL的溶剂才能用于凝胶色谱。一般来说,在选择溶剂时,应该选择与仪器提供的色谱柱兼容的溶剂或溶剂混合物。常用的溶剂体系有:

(1)乙酸乙酯∶环己烷(1∶1)。乙酸乙酯∶环己烷混合溶剂对于各种类型的检材净化效果都非常好,对蔬菜、水果和其它动植物中有机氯农药、有机磷农药、多氯联苯(PCBs)、杀真菌剂和其它半挥发物残留的净化都能满足。此混合溶剂毒性低,是目前首推使用的溶剂。

(2)二氯甲烷∶环己烷(15∶85)。此溶剂系统对含有机磷和含氯杀虫剂的高脂肪性检材的净化效果很好,对水果、蔬菜、谷类等植物类检材的净化效果也较好,是同时净化这两大类检材的最好选择。

(3)二氯甲烷∶环己烷(1∶1)。此溶剂系统多用于含有机氯杀虫剂的动物和家禽等高脂肪检材的净化。它不适合同时检测有机磷和含氯杀虫剂,尤其是当使用ECD 检测器时。

(4)二氯甲烷∶正己烷(1∶1)。此混合溶剂引用USFDA 方法,用于净化各种高油脂食品中的杀虫剂、除草剂。也能用于净化羊毛脂检材,检测有机氯、有机磷杀虫剂。

(5)100% 二氯甲烷。此溶剂系统是传统的EPA 方法,能从土壤、沉淀物、废水中除去大分子和含硫化合物,能完成半挥发物、PCBs、有机氯农药的净化提取。但是,由于二氯甲烷消耗量大、环境污染大、废液处理成本较高,目前已在许多国家禁用。

(三)凝胶渗透色谱净化的特点

1.凝胶渗透色谱法优势。由于GPC 是利用检材中各组分分子量大小不同而实现分离,只要检材中待分离的物质分子量有差异,就可采用GPC 把它们分开,因此GPC 分离的检材范围比较广,且分离效果基本不受检材分子的其它性质影响。GPC 净化是适应各种检材基体的最全能、最便捷的检材制备技术,与传统的液液萃取、索氏提取、活性炭吸附、固相萃取等净化方法相比,GPC具有净化容量大、可重复使用、适用范围广、自动化程度高等特点。通常在利用不同粒径、不同活性、不同柱径的柱子净化检材时应考虑柱子的容量,例如10~20g 的氧化铝柱只有250mg 脂肪的处理容量,所以检材提取物中的脂肪含量不能太高。此外,GPC 系统中的凝胶再生能力很强,且无可逆吸附,所以凝胶性能可保持较长时间,可反复使用。

目前,商品化的 GPC 柱容量都比较大,特别适合处理脂肪含量比较高的检材。商品化的GPC 系统都可以实现自动化,操作非常简单,只要用户设定程序后仪器就能自动运行,提高了检材分析的效率。

2.凝胶渗透色谱法不足

(1)分离不完全。GPC 净化方法是一种分离大分子干扰杂质的方法,能把待测物从各种复杂基质中分离出来,其分离效果的好坏取决于分子的大小、形状以及凝胶阻滞作用的差异,因此对于分子尺寸相同的混合物来说分离效果比较差。另外,由于小分子干扰物可能会被夹带洗脱到待测物中,而较大分子的待测物可能会随着油脂等干扰物先流出,影响回收率。因此,在实际使用中要结合其它前处理方法来实现对复杂检材的富集净化。

(2)溶剂消耗大。由于GPC 柱内径较大,连续处理检材的能力相对较慢,造成溶剂耗费量较大,而且由于收集体积大使得实验室现有的普通浓缩技术成为制约整个分析速度的瓶颈。为解决这些不足,目前商品化的全自动GPC 净化仪都在向净化柱内径小、载荷量大以及小体积进样的方向发展,减少溶剂消耗,提高GPC净化技术分离度,扩展凝胶渗透色谱技术的应用范围。此外,新一代在线浓缩GPC 系统的研制,使得浓缩过程能与GPC 同步,且浓缩速度快,此系统能够自动完成溶剂转换,用户可以自由设定终点体积,满足定量浓缩后直接进行色谱分析,大大提高了GPC 净化效率。

同时, GPC净化技术与传统检材前处理方法和技术结合的新方法和技术也在探索之中,GPC净化技术与溶剂萃取、固相萃取、固相微萃取、超临界流体萃取等前处理技术有机结合,取长补短,可显著提高前处理效率,再与气相色谱、液相色谱、气质联用和液质联用等仪器联用,可以实现自动化分析,大大地提高了分析效率。

五、微透析技术

微透析(microdialysis)技术是由神经化学实验室中的灌流取样技术发展和延伸而来的新技术,是一种从生物活体内进行动态微量生物化学采样、检测的技术。它利用膜透析原理,采用能截留一定分子量的纤维半透膜制成极细的微透析探头(Microdialysis Probe,MDP),在不影响生物体的生命、不破坏(或破坏很少)生物体内环境的前提下,将一种具有透析作用的微细探针直接插到生物活体的脑神经核团、皮肤、血液、肝脏、胆、肾、心脏、肌肉、关节和肿瘤等需采样的部位。利用一部非常精细的注射泵,以恒定速度(0.5~5μL/min)向探头内灌注与组织液成分相近的等渗灌流液,当灌流液流经探头前端透析膜时,位于探头膜外侧的组织内较小分子量生物活性物质将顺浓度梯度从膜外扩散入膜内,并随灌流液被引流出探头外,可以以一定的时间间隔有序接收透析液。由于透析管中的灌流液不断流动更新,因此跨膜浓度梯度始终存在,微透析得以持续进行。微透析技术可以与毛细管电泳、微柱HPLC、质谱、生物传感器、免疫化学分析、化学发光、流动注射等方法联机,连续检测收集的透析液中生物体细胞液的内源性或外源性物质浓度随时间改变的动态变化情况,可对神经递质的分泌、代谢和神经待测物进行动力学研究,免除了复杂的检材前处理及由此产生的检材损失和误差,也不会因在室温取样而酶解,提高了检材的稳定性。

由于该技术可以对活体组织细胞外液进行生物化学采样,可以动态观察、定量分析小分子活性物质,特别适合于深部组织和重要器官的活体生化研究,具有对组织损伤小、取样少、可连续监测且易实现自动化等优点,为医学、药学、毒理学、生命科学等领域提供了崭新的技术发展空间。

(一)微透析技术原理

透析的过程实质上是一个浓度扩散过程,当透析探针刚刚植入体内细胞间液中时,待测物对膜内外而言,是一非平衡状态。由于待测物不断透过膜,由膜外进入膜内,使得流出灌注液中待测物的浓度不断增加。当流出灌注液中待测物的浓度增加到某一值时,即透析探针植入一定时间后,透析过程达到平衡,流出灌注液中待测物的浓度也不再继续增加,达到一恒定值,这时透析探针的回收率保持一常数。透析探针的回收率与膜的长度、膜的几何形状、灌注液流速、待测物的性质及取样时的温度有关。这也是利用微透析技术进行定量分析的理论基础,一般经过30~60min回收率基本稳定。

(二)透析探针回收率测定

微透析的回收率(recovery rate)是指流出灌注液中待测物的浓度(Cd)与探针膜外细胞间液中待测物的浓度(Co)之比:


控制取样条件恒定,灌注液的组成和流速恒定,则微透析的回收率保持一定。确定了透析探针的回收率,根据测定的Cd就可以计算Co。

透析探针回收率的体外(in vitro)校正法已很少使用,目前常用的几种体内校正回收率的方法如下:

1.内标法(intermal standard)。在灌注液中加入已知浓度且性质与待测物相似的另一物质作内标,测其渗出(即内标由膜内透析到膜外)率作为待测物的回收率。这种方法要求内标物不仅在扩散性质上与待测物一致,而且还要在体内代谢过程也尽可能一致。

2.低灌注流速法(low perfusion rate)。将灌注液流速控制在≤50nl/min 水平,使得膜内外达到一种浓度平衡,此时回收率可达90%以上甚至100%,这样就可以计算实验时的回收率。

3.外推法(extrapoiation)。以灌注液流速为横坐标,以不同流速稳态下所对应的流出灌注液中被测物浓度的实验值为纵坐标,将得到的曲线外推至横坐标为零时所对应的浓度即是膜内外达到浓度平衡时体内待测物浓度,以此计算回收率。

4.无净流出量变化点(point of no net flux)。无净流出量变化点即零交换点(zero flux),是将灌注液流速控制恒定,分别测定不同浓度灌注液达到稳态后流出液中欲测物质的浓度,以灌注液浓度为横坐标,灌注液流出与流入的浓度变化为纵坐标得一直线。纵坐标为零时(即无浓度变化)所对应的浓度就是体内待测物的浓度,直线斜率即为透析探针的回收率。该法是目前应用较多、准确、简单的方法。
  6.渗出率法(delivery test)。渗出率法是基于体外实验中发现的回收率与渗出率相同这一现象。用已知待测物浓度的灌注液灌注探针,测定稳定后流出灌注液中待测物浓度,流入与流出浓度差与流入浓度之比就是探针的渗出率。若实验前后渗出率没有变化,则渗出率就可作为回收率,是一种最简单的使用方法。

(三)微透析系统

微透析系统主要包括探针、活性透析膜、连接管、灌注器推进泵、灌流液、微量收集器和分离检测装置等(图4-22)。微透析系统的关键部件是微透析探针,它是由膜、导管及套管等部分组成,探针的长度一般在0.5~10mm,膜材料常用纤维素膜、聚丙烯腈膜和聚碳酸酯膜,这些膜完全不具有化学选择性,小分子进出膜完全由膜孔大小所决定。

 


(四)微透析技术特点

微透析技术最大优点是可在基本不干扰体内正常生命过程的情况下进行在体(in vivo),实时(real time)和在线(on line)取样。

1.时间分辨性。可连续跟踪体内多种化合物量随时间的变化。研究药动学可从同一动物收集大量样本而不损失体液量,避免了传统研究方法中因采血后血容量减少造成的对药物分布及消除的影响,其时间分辨性可使药动学资料更准确。

2.空间分辨性。取样即时即测,可真实代表取样位点目标化合物的浓度,同时在体内不同部位插入探针可研究目标化合物的体内分布。

3.不需预处理。提供不含蛋白质等大分子物质的游离态小分子化合物,检材因不含蛋白质、酶等大分子物质,可不经预处理直接用于测定。对药物研究有重要意义。

4.获取药代中间动态信息。取样可在清醒、自由活动的动物体内多个器官以及同一器官多个位点连续取样,且动物本身自成空白对照,能准确及时掌握到药物代谢的中间动态信息。

不需处死动物和制备组织匀浆,不破坏机体完整性,可维持实际生理条件,消除传统药物代谢研究中因组织均匀化破坏细胞隔室造成对代谢研究结果的影响。减少实验动物数量,并可获得有关药物代谢中间过程的信息。(传统方法对血清、尿或粪便中代谢物浓度测定只能了解代谢的最终产物,而不能反映中间过程)

5. 检材稳定体积恒定。检材中各成分浓度基本不变,膜对药物的非特异性吸附较少。检材不会因在室温取样而酶解,提高检材稳定性,可从容地进行分离和测定。

应用微透析技术可检测的相关物质有葡萄糖、乳酸、丙酮酸、腺苷、黄嘌呤等能量代谢物;谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸类神经递质;尿囊素、尿酸等自由基相关物质;组织损坏标志物甘油;各种药物等。

微透析技术是一种新型的取样和制样方法,它可以连续活体取样,多部分多组分取样,且取出检材不含大分子杂质,可直接用于色谱分析。但该技术仍存在许多不足之处,如探针回收率变化不易控制,取样部位的固定及重现难度较大,对与蛋白质结合的物质及细胞内物质无法取样,需高灵敏度的分析仪器联用等等。但它与传统的生物检材取样和制样有截然不同的构思,在对生物体相关物质研究方面显示出良好的发展前景。

 

 

本章小结

检材处理是分析化学的重要组成部分,是满足仪器分析要求及提高分析灵敏度、准确性、重复性的重要方面。本章主要介绍了适合常规实验室装备的气相色谱仪、气质联用仪、液相色谱仪、液质联用仪、原子吸收(发射)光谱仪、电感耦合等离子体光谱仪等色谱、光谱仪器检测的检材前处理方法与技术。溶剂萃取是依据分配原理利用有机溶剂对液体和固体检材中的有机待测物进行提取的常用方法;固相萃取是利用各种性质的吸附剂对不同类待测物进行提取的方法;顶空萃取主要适用于液体和固体检检材中气体和易挥发待测物的分离测定;蒸馏是利用待分离组分的沸点不同进行分离提取的方法;而微波消解技术主要用于复杂基质中金属元素的分离。衍生化技术通过化学反应改变待测物结构使其适应仪器要求或改善分析效果。不同的检材处理技术依据不同的原理,具有多方面的影响因素,而最基本的依据就是待测物与基体或干扰物质性质上的差异。一些萃取新技术如CO2超临界萃取、微波辅助萃取、加速溶剂萃取、凝胶渗透净化色谱以及微透析技术结合了自然科学领域最新的方法和技术,具有溶剂用量少、样品处理量少、提取效率高、易于自动化、可与其他技术联用等特点。

 

 

思考题

1.为什么要进行检材前处理?常用的检材处理技术有哪些?处理检材必须遵循的原则有哪些?

2.液液萃取的基本原理是什么?如何选择萃取溶剂?如何有效地防止乳化发生?

3.正相固相萃取、反相固相萃取和离子交换固相萃取有哪些不同点?固相萃取中吸附剂如何选择?

4.顶空进样技术进行定量分析的基本原理是什么?

5.蒸馏的形式有哪些?分子蒸馏与传统蒸馏有哪些不同?

6.为什么要对一些检材进行衍生化处理?衍生化处理的方法有哪些?气相色谱和液相色谱中衍生化的目的有哪些不同?

7.超临界流体萃取的基本原理是什么?影响超临界流体萃取的因素有哪些?

8.微波萃取的基本原理是什么?影响微波萃取的因素有哪些?

9.加速溶剂萃取的基本原理是什么?影响加速溶剂萃取的因素有哪些?

10.凝胶渗透色谱净化技术的基本原理是什么?常用溶剂有哪些?